[发明专利]一种利用光敏基因创制避荫性玉米种质的方法

摘要

一种利用光敏色素基因转化玉米愈伤与幼胚，从而创制避荫性玉米种质的方法，属于植物转基因技术及作物遗传育种领域。本发明包括以下步骤：构建光敏色素基因的植物表达载体；植物表达载体通过农杆菌介导的方法转化玉米愈伤组织与幼胚；转化后对再生植株进行PCR检测确定阳性植株；将获得的阳性植株自交留种，获得稳定的高代转基因植株；按随机区组试验设计高低不同密度的种植方案，种植转光敏色素基因植株以及其与常用自交系的杂交组合，统计分析田间株型性状；对实验结果进行分析，筛选避荫性以及产量优良的转基因玉米种质。本发明利用过量表达玉米内源光敏色素基因对其株型的影响，将玉米转基因技术在玉米株型育种上发挥作用，培育可合理密植的玉米品种。

主权项

一种利用光敏色素基因创制避荫性玉米种质的方法，其特征在于包括以下步骤：植基因表达载体的构建：1）目的基因的获得：从玉米B73中分别扩增得到玉米内源光敏色素基因PhyA1、PhyA2、PhyB1；送公司测序后将扩增序列正确的目的基因产物保存在4℃冰箱备用；2）载体大片段的获得：植物表达载体大片段（pTF101.1‑Ubi‑T‑nos）：在pTF101.1基础载体上（其中含有Bar基因作为筛选基因），添加启动子Ubiquitin、终止子T‑NOS后构建的新的表达载体，光敏色素基因（PhyA1、PhyA2、PhyB1）将插入在pTF101.1‑Ubi‑T‑nos载体T‑DNA区中BamHI和SmaI酶切位点间，启动此目的基因表达的是玉米泛素化启动子Ubiquitin，终止此目的基因表达的是T‑nos终止子；植物表达载体大片段（pCUbi1390）：其T‑DNA区中含有潮霉素磷酸转移酶（HPT）选择标记基因和启动潮霉素磷酸转移酶（HPT）的CaMV35S启动子，玉米光敏色素基因（PhyA1、PhyA2、PhyB1）将插入在T‑DNA区中BamHI和SpeI酶切位点间，启动目的基因表达的是玉米泛素化启动子Ubiquitin,终止目的基因表达的是T‑nos终止子；3）准备好上述DNA片段后，再将PhyA1、PhyA2、PhyB1 的DNA片段与载体大片段分别经酶切，于16℃连接过夜，将连接产物经酶切验证后送公司测序；将测序结果正确的连接产物热激转化农杆菌感受态细胞，用壮观素、利福霉素抗性培养基筛选转化的农杆菌，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定；将验证后的农杆菌菌液保存备用；（2） 通过农杆菌介导的方法转化玉米愈伤组织：1）浸染：将含有构建好的植物表达载体的农杆菌接种到含50 mg/L利福平和50 mg/L壮观霉素的YEP培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1 mL YEP培养基中，28℃、180 r/min振荡培养12 h，再将其加入含相应抗生素的50 mL培养基扩大培养至OD₆₀₀=0.5；4℃、4000 r/min离心10 min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含乙酰丁香酮（AS）的浸染培养液，黑暗浸染3 min；2）共培、恢复和筛选：将已浸染了农杆菌的愈伤组织置于含灭菌纸的培养皿上，吸干多余水分后放空皿培养，21℃暗培养3 d；3 d后的愈伤组织接种到恢复培养基上25℃暗培养7 d；恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5 mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上；25 d后将抗性愈伤组织转接到新鲜的筛选培养基上；连续筛选3代，除草剂浓度按1.5 mg/L、3 mg/L、4.5 mg/L递增；每次转接都淘汰褐化的愈伤组织；3）转基因植株的再生：选取抗性愈伤组织，转移到分化培养基上，2‑3周后，将分化出的幼苗转移到生根壮苗培养基上，生根壮苗培养基为：MS盐和维生素+肌醇100 mg/L +生根粉ABT 0.25 g/L+蔗糖30 g/L +琼脂6 g／L, pH 6.0；26℃光照培养16小时/d，即得到T₀ 转基因再生植株；对再生植株进行PCR检测、测序等分子检测，筛选出阳性T₀植株自交留种；（3） 按随机区组试验设计高低不同密度种植方案， 种植转基因植株以及其与常用自交系的（3至5个）杂交组合，调查测定相关数据，对田间试验结果进行分析，筛选获得避荫性以及产量优良的转基因玉米种质。