[发明专利]一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法

摘要

本发明公开了一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，它利用预冷的高氯酸溶液涡旋提取烟草中的多胺，再以3,5‑二硝基苯甲酰氯进行衍生化，衍生化产物利用涡旋辅助‑液液微萃取进行提取浓缩后采用超高效液相色谱‑光电二极管阵列检测器进行检测。此外，为了获得涡旋辅助‑液液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分别采用了部分析因设计和Doehlert设计进行方法优化。本发明与其它分析检测多胺的方法相比，具有衍生反应快、产物稳定，灵敏度高、重现性好、对环境绿色友好等优点，能对烟草中根、茎及叶中的多胺进行准确的定性与定量。此外，通过高分辨率质谱鉴定了其它四种多胺，分别为酪胺、1,3‑丙二胺、高精眯和刀豆四胺，其中刀豆四胺为首次在烟草中发现。

主权项

1.一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、烟草根、茎及叶中多胺类物质的提取：称取冻干样品于离心管中，然后加入内标溶液，再加入预冷的高氯酸水溶液进行涡旋提取，离心后，上层清液过水系滤膜；B、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化：取步骤A中滤液于离心管中，放入冰浴中冷却，再加入氢氧化钠溶液，涡旋混匀后加入预冷的衍生化试剂，涡旋混匀，冰浴中反应后加入盐酸水溶液停止反应；C、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化产物的提取：向步骤B中衍生化产物中加入水，调节溶液pH值后，再加入氯化钠及提取溶剂进行涡旋辅助-液液微萃取，提取结束后用手动进样针取下层提取液至微量进样瓶中，氮气吹干后用乙腈水溶液将衍生化产物溶解后进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器测定；D、烟草根、茎及叶中多胺类物质的色谱检测：采用一级与二级高分辨质谱定性标准品与未知多胺，超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器以己二胺盐酸盐为内标分别进行绝对定量与相对定量；所述的涡旋辅助-液液微萃取的条件为加入1mL超纯水，利用2 M的盐酸将其pH调至1后，再加入2.5%的氯化钠w/v与250 uL三氯甲烷，涡旋辅助液液微萃取3 min，4000 rpm离心4 min分层；所述内标溶液为5 uL 0.1 M 盐酸配制的1 mg mL-1的己二胺盐酸盐；所述的衍生化试剂为1050 uL乙腈配制的50 mM的3, 5-二硝基苯甲酰氯；一级与二级高分辨质谱定性的标准品为腐胺、尸胺、亚精胺和精胺； 一级与二级高分辨质谱定性的未知多胺有酪胺、1, 3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺；超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器利用标准品绝对定量腐胺、尸胺、亚精胺和精胺，利用内标己二胺盐酸盐按照校正因子F=1相对定量酪胺、1, 3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺；一级、二级高分辨质谱Xevo-Q-TOF的条件为：ESI 负模式，氮气为雾化气和锥孔气，雾化气与锥孔气流速为800 L/h和50 L/h，雾化气温度450℃，源温度120℃，毛细管电压：2.0KV，锥孔电压：40 V，碰撞能量 6 eV，扫描时间为0.2 s，间隔为0.02 s，扫描范围70-1000，检测器电压为1950 V；超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器的条件为：ACQUITY UPLC超高效液相色谱分离采用Acquity UPLC HSS T3 柱2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm，柱温45 ℃，进样量为1.0 μL；流动相B为超纯水含0.05% HCOOH，A为质谱级乙腈，流速为0.35 mL/min，梯度洗脱如下：初始20% A保持 1 min，到5 min变为50% A，保持2 min，到12 min变为70%A，保持2 min，到16 min变为100% A，保持2 min，到20 min恢复到20% A，保持2 min，到22min平衡后进下一针；光电二极管阵列检测器的监测波长为240 nm，分辨率为4.8 nm。