[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用

摘要

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，包括以下步骤：1多聚甲醛固定制备菌抗原；2菌抗原注射免乳化；3短间隔脉冲注射快速促发免疫；4实体瘤种植复壮瘤细胞；5化学诱导融合；6半流体选择得单克隆杂交瘤；7阴阳性筛选配合得特异性抗体；8多抗作捕捉抗体，单抗作检测抗体组建双抗夹心ELISA。

主权项

1.一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)固定：使用一定浓度的多聚甲醛在合适的温度下孵育处理，使得蜡样芽孢杆菌的表面成分固定，得到的菌抗原的抗原决定簇与活菌的状态一致，然后离心洗涤，得到菌抗原；(2)免乳化：将固定好的蜡样芽孢杆菌用生理盐水悬浮调至合适菌浓度，准备动物免疫；(3)短间隔脉冲免疫：选择六个外周免疫位点以肌肉注射方式，在短间隔脉冲免疫期内，将制备得到的细菌抗原悬浮液注射到BALB/c小鼠体内；六个外周免疫位点为腹股沟、腋窝、脚蹼的两侧对称位点，短间隔脉冲免疫是指在第1,3,6,8,10和13天时以肌肉注射的方式，注射浓度为109～108，108～107，106～105，105～104，105～104，105～104cells/mL无免疫佐剂辅助的菌抗原悬浮液；(4)实体瘤种植：取6～8周龄的免疫缺陷型小鼠BALB/c，制备SP2/0骨髓瘤RPMI1640悬浮液，悬浮液的细胞浓度调整为1～10×107cells/mL，以皮下注射方式注射到小鼠颈部，8～10天后观察出现明显凸起，并有拇指大硬块即为实体瘤；(5)细胞融合：融合用骨髓瘤细胞悬浮液是将实体瘤取出利用组织研磨器及细胞筛制备得到；选血清滴度高的小鼠供脾脏及淋巴结，制备脾脏及淋巴细胞混合悬浮液，与一定比例的骨髓瘤细胞悬浮液混匀离心，扣干，在一定时间范围内加入一定浓度的化学诱导融合剂，在一定温度范围内静置孵育一定时间，加入不完全培养基终止反应；(6)半流体选择性培养：向含有选择性成分HAT的完全培养基添加一定质量的增稠剂使得培养基成为半流体状，将融合细胞均匀分散在半流体培养基，于二氧化碳细胞培养箱培养；(7)消减筛选：将获得杂交瘤细胞上清，首先进行一定轮数的阳性筛选，然后进行相应轮数的阴性筛选，阴性筛选选取蜡样芽孢杆菌相似菌作为筛选抗原，蜡样芽孢杆菌的相似菌为苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，产气荚膜杆菌，得到的杂交瘤细胞即为所取。