[发明专利]高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法

摘要

本发明公开了一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：合成依次由里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn‑LVK基因序列和里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；将表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；将重组表达质粒和pAN7‑1载体轻轻混匀，共转里氏木霉原生质体，经筛选得到高产热稳定性木聚糖酶xyn‑LVK的里氏木霉基因工程菌。本发明中木聚糖酶xyn‑LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn‑LVK在毕赤酵母中的表达相比，木聚糖酶xyn‑LVK的产量提升约40%。

主权项

1.一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：（1）合成依次由里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉 cbh1 信号肽序列、木聚 糖酶 xyn‑LVK 基因序列和里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；（2）利用 PCR 技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶 EcoRI，XbaI 将所述表达框序列克隆至 pUC19 中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：上游引物： CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC，其中，下划线为 EcoRI酶切位点；下游引 物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG，其中，下划线为 XbaI 酶切位点；（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DH5a，阳性转化子进行 DNA 测序， 测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；（4）抽提所述重组表达质粒，将所述重组表达质粒和 pAN7‑1 载体混匀，共转里氏木霉原 生质体，涂布于含抗生素的 PDA 固体平板上，进行培养；（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的 PDA 固体平板上长孢子；（6）用无菌水制备孢子悬液，取孢子接种于基本培养基中培养 48 小时后转接到产酶培养基中培养 196 小时；取菌液离心，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性 的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶 xyn‑LVK 的里氏木霉基因工程菌； 其中，所述木聚糖酶 xyn‑LVK 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示，所述木聚糖酶基因 xyn‑LVK 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。