[发明专利]金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法

摘要

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，包括：(1)pET‑FnbpB‑D的诱导表达；(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备；(3)抗体抗黏附能力的检测。本发明通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后，再对表达产物的特异性抗体的抗黏附能力进行检测，进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考。本发明还为金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

主权项

金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)pET‑FnbpB‑D的诱导表达首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构建的重组质粒，并利用表达载体pET‑32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后，经鉴定，诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在，然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行大量表达纯化，得到目的蛋白；(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，实验兔背部多点注射免疫，注射量为600μg/只，2周后，将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，进行加强免疫；1周后，实验兔耳缘静脉采血后，制备得到含有抗体的抗血清；(3)抗体抗黏附能力的检测，包括以下步骤：①5μg/mL牛纤维蛋白原包被酶标板，4℃过夜；②往酶标板中加入5％脱脂乳作为封闭液，37℃封闭3h得到封闭好的酶标板；③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min；④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中，以未经抗血清孵育的S.aureus做对照，37℃作用2h，PBST洗涤3次；⑤25％甲醛固定30min，洗涤同上；⑥用结晶紫染色30min，洗涤同上；⑦最后用95％乙醇脱色两次，每次5min；⑧在波长405nm处测定经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的OD值；根据测定值，计算经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的平均OD405nm值以及标准差，从而对抗体的抗黏附能力进行判定。