[发明专利]一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法

摘要

本发明公开了一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，包括如下步骤：（1）血浆去冷胶；（2）第一次强阴离子交换柱层析；（3）PEG沉淀去杂蛋白；（4）S/D病毒灭活；（5）第二次强阴离子交换柱层析分别得到FVII洗脱液与FIX洗脱液；（6）弱阴离子交换柱层析纯化凝血FVII；（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX；（8）超滤；（9）加稳定剂及调节；（10）纳米膜除病毒过滤；（11）除菌过滤并分装；（12）冻干；（13）干热病毒灭活。本发明采用PEG沉淀去杂蛋白，通过离子交换层析结合亲和层析纯化技术，实现了同时制备高纯FVII及FIX的目标，工艺流程简单，生产周期短，产品经三步病毒灭除措施，使用安全性高。

主权项

一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）去冷胶血浆的制取将新鲜冰冻血浆融化，在0‑3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用颇尔公司生产的Supradur 50P滤板串联0.45µm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为0.01M‑0.02M， 氯化钠浓度为0.075M‑0.15M 氯化钠，缓冲液PH值为6.50‑7.50，温度10‑15℃；（2）第一次强阴离子交换柱层析    步骤（1）得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡;上柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII与FIX的溶液； （3）PEG沉淀去杂蛋白     在步骤（2）收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3‑6%, 搅拌0.5‑1.5小时，后用1.0µm滤芯过滤，收集澄清的滤液；（4）S/D病毒灭活在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80 至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯） 至0.3%（wt%），搅匀后升温至24‑26℃，后保温6‑7小时；（5）第二次强阴离子柱层析   将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上强阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液2平衡;上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即为凝血FIX粗品；（6）弱阴离子柱层析纯化凝血FVII将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2‑4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0.45µm滤芯过滤得到澄清滤液；（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX    将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上肝素亲和柱，柱子预先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用0.45µm滤芯过滤,所得滤液即为精制的凝血FIX溶液；（8）超滤用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒体积透析4‑6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包；（9）加稳定剂及调节按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值（一般为20‑30IU/ml），后分别加入稳定剂并分别调PH值至6.50‑7.50；（10）纳米膜除病毒过滤分别用15‑20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤；（11）除菌过滤并分装分别用0.22µm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行（12）冻干分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉；（13）干热除病毒过滤分别或同时将FVII及FIX冻干品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。