[发明专利]一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法及应用

摘要

本发明公开了一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法及应用，利用本发明提供的方法，可从猪肝脏中分离出大量具有高活力的门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞，所得细胞能保持良好的原代肝细胞形态特征、肝细胞的功能以及良好的细胞增殖活力，为门静脉周、肝静脉周肝细胞的分离与鉴定，对体外研究门静脉周、肝静脉周肝细胞代谢差异以及更深层次探索肝脏营养物质代谢的奥秘提供基础。

主权项

1.一种猪门静脉周肝细胞或肝静脉周肝细胞分离的方法，包括以下步骤：1)结扎新鲜猪肝脏后腔静脉的远肝端，安装门静脉插管；用37℃预热的灌注溶液A，从门静脉进行灌注，持续灌注直到后腔静脉的近肝端插管安装成功；2)A：门静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，从步骤1)中后腔静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色斑点，停止灌注；10‑30s后，开始从步骤1)中门静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，直到后腔静脉流出的液体变清即可；B：肝静脉周肝细胞分离灌注：用37℃预热的灌注溶液A1，从步骤1)中门静脉进行灌注，持续灌注直到肝脏表面出现均匀的白色网络时，停止灌注；10‑30s后，开始从步骤1)中后腔静脉，用37℃预热的灌注溶液B1灌注，直到门静脉流出的液体变清即可；3)A：门静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从门静脉持续灌注，以肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从门静脉进行灌注，直至消化完全；B：肝静脉周肝细胞分离消化：用37℃预热的灌注溶液B2从后腔静脉持续灌注，当肝脏变成黄白，且组织变松散即可；再用37℃预热的灌注溶液C从后腔静脉持续灌注，直至消化完全；4)将步骤3)消化完全的肝组织转移无菌平皿中，加入预冷的Hanks液，剪碎和吹打肝组织，形成细胞悬液；5)将步骤4)中的细胞悬液分别过100目、200目、400目细胞筛，即得目的细胞的单细胞悬液；所述灌注溶液A配方：6.9g/L氯化钠、0.35g/L氯化钾、0.28g/L氯化钙、0.14g/L硫酸镁、0.27g/L磷酸二氢钾、2.1g/L碳酸氢钠、2.0g/L葡萄糖，其余为三蒸水，调pH至7.4；灌注溶液A1配方包括：在灌注溶液A使用前加入7mmol/L洋地黄皂苷；PBS缓冲液配方包括：8g/L氯化钠、0.20g/L氯化钾、0.6g/L氯化钙、1.83g/L十二水磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、2g/L葡萄糖，其余为三蒸水，调pH值7.2至7.4；灌注溶液B1配方包括：PBS缓冲液使用前加入1.46g/L乙二胺四乙酸，调pH值7.2至7.4；灌注溶液B2配方包括：PBS缓冲液使用前加入0.6g/L氯化钙，调pH值7.2至7.4；灌注溶液C配方包括：PBS缓冲液使用前加入0.6g/L氯化钙和0.5g/LⅣ型胶原酶，调pH值7.2至7.4；所述Hanks液使用前加入10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。