[发明专利]一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法

摘要

本发明公开了一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物（PCC）的方法,包括以下步骤：（1）Cohn血浆组分III溶解；（2）聚乙二醇（PEG）沉淀去杂蛋白；（3）S/D病毒灭活；（4）强阴离子交换柱层析；（5）超滤透析并浓缩；（6）加稳定剂及调节；（7）纳米膜除病毒过滤；（8）除菌过滤并分装；（9）冻干；（10）干热病毒灭活。本发明采用高效强阴离子交换柱层析，代替了传统的批处理凝胶吸附，大大减少了操作的劳动强度，并避免了批处理方法产生的交叉污染问题，同时在整个生产流程中，对制品采用三步病毒灭活及去除措施，具有流程简洁，生产周期短，操作容易，制品使用安全可靠的优点。

主权项

一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）Cohn血浆组分III溶解   按一定的稀释比，将冰冻的Cohn血浆组分III沉淀悬浮于溶解缓冲液中，在10‑25℃下，均匀搅拌2‑4小时，使沉淀充分溶解，得到均匀悬浮液；（2）聚乙二醇（PEG）沉淀去杂蛋白   在步骤（1）所述的悬浮液中加入50%PEG溶液，搅拌0.5‑1.5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+1.0um滤芯，用步骤（1）所述的溶解缓冲液预洗滤板及滤芯，收集澄清滤液；（3）S/D病毒灭活   在步骤（2）所述的滤液中加入Tween80 至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯） 至0.3%（wt%），搅匀后升温至24‑26℃，后保温6‑8小时；（4）强阴离子交换柱层析   将步骤（3）所述的S/D后的溶液降温至5‑20℃，然后上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液平衡;上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液即为凝血酶原复合物，用0.45µm或0.22µm滤芯过滤以上洗脱液,收集澄清滤液；（5）超滤透析并浓缩    用5k‑10k分子量的超滤膜浓缩步骤（4）所收集的滤液，并用透析液透析4‑6倍，后再次浓缩后移出超滤膜包；（6）加稳定剂及调节    在步骤（5）所收集的浓缩液中加入稳定剂，并按照所需规格，调节人凝血因子IX的效价至所需值（一般为20‑30IU/ml），后调PH值至6.50‑7.50；（7）纳米膜除病毒过滤    用15‑20纳米的滤芯对步骤（6）获得的PCC溶液进行除病毒过滤，收集滤液；（8）除菌过滤并分装    用0.22µm除菌滤芯对步骤（7）获得的滤液进行除菌过滤并分装；（9）冻干；（10）干热病毒灭活将步骤（9）获得的PCC冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。