[发明专利]水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法

摘要

本发明水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法属于把隐性孔雀石绿变为孔雀石绿的一次性测定总量方法。本发明最关键是发现了隐性孔雀石绿溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，隐性孔雀石绿平均98.86％变为孔雀石绿，而原有的孔雀石绿不变化，使本发明要把样品中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿在一次测定中，用高效液相色谱仪可以测出隐性孔雀石绿和孔雀石绿的总浓度。本发明大大缩短样品前处理时间和减少试剂耗材的使用，运用电化学柱前衍生代替国标中二氧化铅的柱后衍生。具有样品前处理简单、净化效果好、衍生化率高、回收率好的特点。

主权项

水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法，其步骤如下：一、试剂标准物质：孔雀石绿，含量98.0％；和隐性孔雀石绿，含量98.0％；乙腈，色谱纯，含量大于99.9％；冰乙酸，色谱纯，含量大于98％；无水乙酸铵，色谱纯，含量大于99.9％；二氯甲烷，色谱纯，含量大于99％；酸性氧化铝固体吸附剂，粒径50‑200μm；氯化钠，分析纯，含量大于99.8％；二、制备标准物质孔雀石绿的待测定溶液准确称取标准物质孔雀石绿10mg，用乙腈溶解孔雀石绿，配制成含孔雀石绿浓度为1.0mg/L的标准物质孔雀石绿待测定溶液，即获得A待测定的标准溶液，待用色谱仪检测；三、制备标准物质隐性孔雀石绿的待测定溶液准确称取标准物质隐性孔雀石绿10mg，用乙腈溶解隐性孔雀石绿，配制成含孔雀石绿浓度为1.0mg/L的标准物质隐性孔雀石绿待测定溶液，即获得B待测定的标准溶液，待用色谱仪检测；四、制备样品物质孔雀石绿和隐性孔雀石绿的待测定溶液(1)配制溶液：配制缓冲液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL蒸馏水中，冰乙酸调pH至4.5；过0.45μm水系滤膜；配制提取液：将乙腈∶二氯甲烷按体积比为2∶1混匀后备用；(2)制备样品C待测定的样品溶液取2.0g待测样品捣碎后放于50mL离心管中，加入乙酸铵缓冲溶液3mL和提取液5mL，用涡旋混匀后，放入超声波提取器中，用超声波促进组织细胞内孔雀石绿和隐性孔雀石绿溶解于液体中，用超声波促溶30min，加入酸性氧化铝固体吸附剂1g，加入氯化钠1g，涡旋提取2min，于离心机上8000r/min转速离心5min，取上清液在45℃旋转蒸发至干，用2.0mL的乙腈溶解，0.45μm有机滤膜过滤，该过滤液是含有孔雀石绿和隐性孔雀石绿的待测定溶液，即C待测定的样品溶液；五、高效液相色谱仪的色谱检测条件高效液相色谱仪的设置为：用C18色谱柱，150mm×4.6mm，5μm，流动相为体积比78∶22的乙腈：pH＝4.5的乙酸铵缓冲溶液，流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温35℃；六、用A待测定的标准溶液校正孔雀石绿在高效液相色谱仪的吸收波长和测定误差a％：(6.1)加电场测定：把孔雀石绿的标准溶液即A待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把A待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，再经过C18色谱柱，在紫外检测器检测618nm波长下检测含孔雀石绿的浓度值；即测出A待测定的标准溶液中含孔雀石绿的浓度值；用含孔雀石绿的浓度值a1与步骤“二”中孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得测定孔雀石绿的误差为a1％；(6.2)不加电场测定：把孔雀石绿的标准溶液即A待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把A待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压0.0mv，流速1.0mL/min，再经过C18色谱柱，在紫外检测器检测618nm波长下检测含孔雀石绿的浓度值；即测出A待测定的标准溶液中含孔雀石绿的浓度值；用含孔雀石绿的浓度值a2与步骤“二”中孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得孔雀石绿的测定误差为a2％；当a1％＝a2％，或当(a1％‑a2％)/100的误差小于千分之一，用a1％和a2％的平均值作为a％；当a％小于百分之一后，进行下一步测定；七、用B待测定的标准溶液测出了隐性孔雀石绿被氧成孔雀石绿后，用高效液相色谱仪的测定误差b％：把隐性孔雀石绿的标准溶液即B待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把B待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，把隐性孔雀石绿被还原成孔雀石绿，再经过C18色谱柱后，用紫外检测器检测618nm波长下检测转化成的孔雀石绿的浓度值；用转化成的孔雀石绿的浓度值与步骤“二”中隐性孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得隐性孔雀石绿的测定误差为b％；八、测定C待测定的样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c，mg/L；在加电场条件下测定：样品C待测定的样品溶液用步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，C待测定的样品溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，孔雀石绿含量不变化，隐性孔雀石绿被氧化成孔雀石绿，再经过C18色谱柱后，用紫外检测器检测在618nm波长下检测，测定出C待测定的样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c，mg/L；九、测定C待测定的样品溶液中孔雀石绿的浓度d，mg/L；在不加电场条件下测定：样品C待测定的样品溶液用步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，C待测定的样品溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压0.0mv，流速1.0mL/min，孔雀石绿含量不变化，隐性孔雀石绿含量也不变化，再经过C18色谱柱与其他物质分离后，用紫外检测器检测在618nm波长下检测，测定出C待测定的样品溶液中孔雀石绿的含量为d，mg/L，d中不含有隐性孔雀石绿的量；十、计算样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度为e，mg/L：样品中孔雀石绿的实际浓度为f＝d×100÷a，mg/L；样品中隐性孔雀石绿的实际浓度为g＝(c‑d)×100÷b，mg/L；样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度为e＝f+g，mg/L；用样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度e换算成2.0g待测样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际量。