[发明专利]基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法

摘要

本发明公开了一种基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，即通过腺病毒载体转大鼠OPN基因从而达到体外促进大鼠原代肝细胞增殖的方法，包括步骤：（1）大鼠OPN基因的获得；（2）重组腺病毒载体的构建；（3）腺病毒的包装与扩增；（4）大鼠原代肝细胞的分离与培养；（5）腺病毒对大鼠原代肝细胞的体外侵染。本发明提供的方法成本低廉，操作简单，并且能够达到很好的促肝细胞体外增殖的效果。

主权项

1.基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，其特征在于通过腺病毒载体将大鼠OPN基因导入大鼠原代肝细胞中诱导大鼠肝细胞的体外增殖，其中大鼠OPN基因序列为：atgagactgg cagtggtttg cttttgcctg ttcggccttg cctcctgtct cccggtgaaa  60gtggctgagt ttggcagctc ggaggagaag gcgcattaca gcaaacactc agatgctgta  120gccacttggc tgaagcctga cccatctcag aagcagaatc ttctagcccc acagaattct  180gtgtcctctg aagaaacgga tgactttaag caagaaactc ttccaagcaa ctccaatgaa  240agccatgacc acatggacga tgatgacgac gacgatgacg atggagacca tgcagagagc  300gaggattctg tgaactcgga tgaatctgac gaatctcacc attccgatga atctgatgag  360tccttcactg ccagcacaca agcagacgtt ttgactccaa tcgcccccac agtcgatgtc  420cctgacggcc gaggtgatag cttggcttat ggactgaggt caaagtccag gagtttccct  480gtttctgatg aacagtatcc cgatgccaca gatgaggacc tcacctcccg catgaagagc  540caggagtccg atgaggctct caaggtcatc ccagttgccc agcgtctgag cgtgccctct  600gatcaggaca gcaacgggaa gaccagccat gagtcaagtc agctggatga accaagcgtg  660gaaacacaca gcctggagca gtccaaggag tataagcaga gggccagcca cgagagcact  720gagcagtcgg atgcgatcga tagtgccgag aagccggatg caatcgatag tgcggagcgg  780tcggatgcta tcgacagtca ggcgagttcc aaagccagcc tggaacatca gagccacgag  840tttcacagcc atgaggacaa gctagtccta gaccctaaga gtaaggaaga tgataggtat  900ctgaaattcc gcatttctca tgaattagag agttcatctt ctgaggtcaa ttaa        954；具体步骤为：（1）大鼠OPN基因的获得，通过PCR方法从大鼠再生肝组织中获得OPN基因的开放阅读框片段，并对产物进行双酶切；（2）重组腺病毒载体的构建，对腺病毒载体pHBAd‑MCMV‑RFP进行双酶切，将酶切好的OPN基因的开放阅读框片段与酶切载体连接，通过转化、筛选阳性克隆和摇菌后提取含有OPN基因的重组质粒；（3）腺病毒的包装与扩增，采用脂质体法将重组OPN质粒和骨架质粒共转染293细胞后收毒并扩增，对第三代病毒进行感染性滴度测定；（4）大鼠原代肝细胞的分离与培养，采用两步灌流法分散大鼠肝脏细胞，用体积浓度为60% Percoll离心法分离、纯化肝细胞，并铺于胶原蛋白预处理的培养板上培养；（5）腺病毒对大鼠原代肝细胞的体外侵染，按照MOI=50的比例加入腺病毒颗粒侵染大鼠原代肝细胞以诱导肝细胞的体外增殖。