[发明专利]一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法

摘要

一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法，包括如下步骤(1)取海桐新鲜种子为外植体，进行消毒；(2)将消毒外植体置于MS基本培养基中诱导无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗的子叶置于MS胚性愈伤诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；(4)将所述胚性愈伤组织置于MS胚状体萌发培养基中，诱导再生植株；(5)将所述再生植株置于MS壮苗培养基中培养，获得完整小苗；(6)将所述完整小苗组培瓶瓶盖打开，室温炼苗4‑7d，取出幼苗并洗净根部培养基，移栽到浇透水的蛭石基质中，室温生长一个月后，移栽到大田，每天早晚各喷雾一次。采用本发明能够在短时间内获得大量、优质海桐种苗，移栽成活率在95％以上，有效解决规模化育苗问题，也为实现海桐转基因研究、生物技术育种等提供了基础。

主权项

一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15‑30min，添加了2‑3滴吐温‑20的0.1v/v％升汞100mL消毒8‑10min，无菌水冲洗3‑5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23‑27℃，黑暗的条件下培养20d得到无菌试管苗，其中，MS培养基中添加GA30.1‑0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8；3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶置于MS胚性伤组织诱导培养基中，在培养温度为23‑27℃，光照强度1500lux，光照时间为8‑10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性伤组织诱导培养基添加2，4‑D0.5‑2.5mg/L、TDZ0.5‑2.0、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤组织置于MS萌发培养基中，在培养温度为23‑27℃，光照强度1500lux，光照时间8‑10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株，其中，MS萌发培养基中中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8；(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23‑27℃，光照强度1500lux，光照时间8‑10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗，其中，MS壮苗培养基中添加6‑BA0.1‑0.5mg/L、NAA0.05‑0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在温度为25℃的室内炼苗4‑7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后移栽到大田。