[发明专利]一种巴氏杀菌乳中复原乳的鉴别方法

摘要

本发明提供一种巴氏杀菌乳中复原乳的鉴别方法，当每100g蛋白质中糠氨酸含量小于或等于12.0mg，判定为不含复原乳的正常巴氏杀菌乳；当每100g蛋白质中糠氨酸含量大于12.0mg且小于等于25.0mg时，L/F＜0.5，则判定为含有复原乳的巴氏杀菌乳；当每100g蛋白质中糠氨酸含量大于25.0mg时，L/F＜1.1，则判定为含有复原乳的巴氏杀菌乳。本发明提高了乳制品检测方法的权威性，保障消费者知情权、保护奶农利益、促进了民族奶业健康发展。

主权项

1.一种巴氏杀菌乳中复原乳的检测方法，所述巴氏杀菌乳中不添加营养强化剂，或仅添加矿物质和/或维生素，其特征在于：首先，测定样品中糠氨酸含量，其步骤如下：步骤一、采样：取不少于200mL液态奶样品；步骤二、水解液的制备：吸取2.00mL样品，置于密闭耐热试管中，加入6mL的10.6mol/L盐酸溶液，混匀，往试管中缓慢通入纯度为99.99％的氮气1min～2min，密闭试管，将试管置于干燥箱，在110℃下加热约1h后，轻轻摇动试管，继续加热直至加热23h～24h，加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后过滤，制得水解液；步骤三、水解液中蛋白质含量的测定：吸取2.00mL步骤二制得的水解液，按GB/T5009.5测定水解液中蛋白质含量；步骤四、水解液的纯化：将C18萃取柱安装在注射器上，分别用5mL甲醇和10mL水润湿萃取柱，保持萃取柱湿润状态，吸取0.500mL步骤二中水解液于萃取柱，用注射器缓慢推入C18萃取柱内，吸取3mol/L盐酸溶液缓慢洗脱萃取柱中的样品至3mL；步骤五、糠氨酸含量的测定，采用UPLC法测定：1)色谱参考条件：色谱柱：WATERS ACQUITY HSS T₃色谱柱，1.8μm，100mm×2.1mm柱温：30℃流动相：6g/L的KCl溶液为流动相A，甲醇为流动相B，纯水为流动相C洗脱条件：流动相A，0.4mL/min2)测定：分别利用流动相B、C、A以0.4mL/min的流速依次平衡色谱系统，注入2μL～5μL的3mol/L盐酸溶液平衡柱子，以检测溶剂的纯度，注入2μL步骤四得到的纯化后的水解液，测定糠氨酸含量；步骤六、糠氨酸含量以质量分数W计，数值以毫克每百克蛋白质表示，按下述公式计算：W＝(At×Cstd×D×100)÷(Astd×m)式中：W：样品中糠氨酸含量，单位为毫克每百克蛋白质；At：样品中糠氨酸峰面积的数值；Astd：糠氨酸标准溶液中，糠氨酸峰面积的数值；Cstd：糠氨酸标准溶液的浓度，单位为mg/L；D：测定时稀释倍数，D＝6；m：样品水解液中蛋白质浓度，单位为克每升；其中，糠氨酸标准溶液的浓度为2μg/mL；其次，测定样品中乳果糖含量，步骤如下：步骤一、采样：取不少于200mL液态奶样品；步骤二、纯化：量取20.0mL样品到200mL锥形瓶，依次加入20.0mL水，7.0mL浓度为130g/L的亚铁氰化钾溶液、7.0mL浓度为168g/L的硫酸锌溶液和26.0mL缓冲液A，每加入一种溶液后，充分振荡均匀，全部溶液加完后，静置10min，过滤，弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液；步骤三、水解乳糖和乳果糖：吸取5.00mL步骤二中的滤液置于10mL容量瓶，加200μl的β‑D‑半乳糖苷酶悬浮液，混匀后加盖，在50℃恒温培养箱中培养1h；步骤四、葡萄糖氧化：在步骤三中得到的水解液中依次加入2.0mL缓冲液C、100μL葡萄糖氧化酶悬浮液、1滴辛醇、0.5mL浓度为0.33mol/L的氢氧化钠溶液、50μL过氧化氢和50μl过氧化氢酶悬浮液，每加一种试剂后应轻轻摇匀，全部溶液加完后，在40℃恒温培养箱中恒温3h，冷却后定容至10mL，过滤，弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液；步骤五、依照步骤三和步骤四处理空白溶液，所述空白溶液为不加β‑D‑半乳糖苷酶悬浮液；步骤六、乳果糖含量的测定：步骤见下表：步骤七、乳果糖含量计算：样品吸光值差ΔAs按下述公式计算：ΔAs＝As2‑As1空白吸光值差ΔAb按下述公式计算：ΔAb＝Ab2‑Ab1样品净吸光值差ΔAL按下述公式计算：ΔAL＝ΔAs－ΔAb乳果糖的含量以质量浓度c计，数值以毫克每升表示，按下述公式计算：c＝(ML×V1×8)÷(ε×d×V2)×ΔAL式中：ΔAL：样品净吸光值差；ML：乳果糖的摩尔质量，342.3g/mol；ε：NADPH在340nm处的摩尔吸光值，6.3L·mmol‑1·cm‑1；V1：比色皿液体总体积，3.240mL；V2：比色皿中滤液的体积，单位为毫升；d：比色皿光通路长度，1.00cm；8：稀释倍数；其中：缓冲液A的配制方法为：称取4.8g Na2HPO4，0.86g NaH2PO4·H2O和0.1g MgSO4·7H2O溶解于80mL水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH在20℃时为7.5±0.1，定容到100mL；缓冲液B的配制方法为：称取14.00g N(CH2CH2OH)3HCl和0.25g MgSO4·7H2O溶解于80mL水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH在20℃时为7.6±0.1，稀释到100mL；缓冲液C的配制方法为：量取40.0mL缓冲液B用水定容到100mL，摇匀；β‑D‑半乳糖苷酶悬浮液的配制方法为：用3.2mol/L硫酸铵溶液将活性为12.6IU/mg的β‑D‑半乳糖苷酶制备成浓度为150mg/mL的悬浮液；葡萄糖氧化酶悬浮液的配制方法为：用灭菌水将活性为200IU/mg的葡萄糖氧化酶制备成浓度为20mg/ml悬浮溶液；过氧化氢酶悬浮液的配制方法为：用灭菌水将活性为65000IU/mg的过氧化氢酶制备成浓度为20mg/mL的悬浮液；己糖激酶/葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶悬浮液的配制方法为：在1mL3.2mol/L硫酸铵溶液中加入2mg活性为140IU/mg的己糖激酶和1mg活性为140IU/mg的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶，轻轻摇动成悬浮液；磷酸葡萄糖异构酶悬浮液的配制方法为：用3.2mol/L硫酸铵溶液将活性为350IU/mg的磷酸葡萄糖异构酶制备成浓度为2mg/mL的悬浮液；ATP溶液的配制方法为：将50mg的5’‑ATP‑Na2和50mg碳酸氢钠溶于1mL水中；NADP溶液的配制方法为：将10mgβ‑NADP‑Na2溶于1mL水中；第三，根据样品中乳果糖含量和糠氨酸含量确定其是否含有复原乳：当所述巴氏杀菌乳的检测样品中乳果糖含量高于100.0mg/L时，样品为非巴氏杀菌乳；当每100g蛋白质中糠氨酸含量小于或等于12.0mg，样品为不含复原乳的正常巴氏杀菌乳；当每100g蛋白质中糠氨酸含量大于12.0mg且小于等于25.0mg，且L/F≥0.5，样品为不含复原乳的正常巴氏杀菌乳；当每100g蛋白质中糠氨酸含量大于12.0mg且小于等于25.0mg，且L/F＜0.5，样品为含有复原乳的正常巴氏杀菌乳；当每100g蛋白质中糠氨酸含量大于25.0mg时，且L/F＜1.1，样品为含有复原乳的巴氏杀菌乳；式中：L：样品中测定的乳果糖含量，单位为毫克每升；F：样品中测定的糠氨酸含量，单位为毫克每百克蛋白质。