[发明专利]一种DNA标记抗体的方法

摘要

本发明公开了一种DNA标记抗体的方法，采用异型双功能偶联剂活化抗体上的氨基，通过共价键偶联巯基化DNA，形成DNA和抗体的复合物。通过本发明方法得到的DNA抗体复合物，抗体和DNA分子比例固定，可以用于免疫PCR等相应的实验。

主权项

一种DNA标记抗体的方法，其特征在于，包括：合成巯基修饰的DNA：设计两条引物，一条巯基化修饰P1：HO‑C6‑S‑S‑C6‑PO3‑TTCTCATGTTTGACGCTT，一条不用任何修饰P2：CGGAATGGACGATATCCCGC，以pBR322质粒为模板，扩增200bp长度的片段，巯基化引物和普通引物以50:1的比例加入到PCR体系中，不对称PCR扩增使扩增片段带上巯基修饰，得到巯基化DNA；透析抗体和纯化DNA：以PBS或者双蒸水透析抗体，以核酸纯化柱纯化巯基化DNA，最后用水溶解巯基化DNA；偶联剂活化抗体：将透析过的抗体和交联剂SMCC按分子摩尔比以1:5的比例混合，SMCC浓度2mg/L，25℃搅拌反应1小时，用Histrap Desalting G25在AKTA purifier 100上脱盐，洗脱液为PBS，流速为5ml/min，得到样品A；偶联剂活化的抗体与巯基化DNA的交联：把巯基化DNA溶解在100nM pH7.5 体积为900 ul的磷酸缓冲液中，加入100ulDTT，室温孵育1h，得到样品B；用脱盐的方法去除DTT和从巯基化DNA上脱离的保护基团：用缓冲液预先平衡NAP‑10柱子，加1 mL的上述样品B，用1.5 mLPBS缓冲液进行洗脱，流速为5ml/min，得到巯基化DNA纯化产物，立刻用于连接；将上述样品A和所述巯基化DNA纯化产物等摩尔数混合25℃反应1小时，加入10 μL 1mol/Lβ‑巯基乙醇终止反应，25℃反应30min后纯化；纳米磁珠法纯化偶联产物：在DNA和抗体的偶联物混合液中加入羧化的磁粒，然后用 PEG/ NaCl 沉淀，使目的DNA 吸附至磁珠，最后磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤，用水洗脱。