[发明专利]一种100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法

摘要

本发明属于分子生物学试剂制备技术领域，具体公开了一种100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法。所述方法采用无缝克隆与聚合酶链式反应相结合的方法，具体包括如下步骤：以10个重组质粒为模板，用1对特异性引物，在有PCR mix存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下进行聚合酶链式反应，同时合成10条DNA片段，所得DNA带的长度分别为：400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp，再经纯化、混合而成。本发明的特点是能按预定目标快速、精确、大量地制备用于DNA分子量标志物的不同长度的DNA分子。

主权项

一种100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法，其特征在于，采用无缝克隆与聚合酶链式反应相结合的方法，具体包括如下步骤：以10个含有DNA片段的重组质粒为模板，用1对特异性引物，在有PCR mix存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下进行聚合酶链式反应，同时合成10条DNA片段，所得DNA带的长度分别为：400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp，再经纯化、混合而成：(1)模板DNA：采用10个含有DNA片段的重组质粒；(2)1对引物的DNA序列如下：上游引物‑SjF：5’‑GGATATCTGTGGATCCGA‑3’；下游引物‑SjR：5’‑GGTGGTGGTGCTCGAGTG‑3’；每条引物溶液的浓度为10μmol/L；(3)DNA条带的制备‑聚合酶链式反应：取10个PCR用薄壁离心管，分别标上400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp的标志，按以下方案，在每个管中加入聚合酶链式反应用的试剂：(4)扩增反应条件为95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min，共30个循环；72℃延伸10min，10℃保存；(5)扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，确定片段大小；(6)片段确定后，使用PCR产物纯化试剂盒对剩余扩增的PCR产物进行纯化，测定浓度后‑20℃保存备用。(7)100bp梯度DNA分子量标志物的构建：将400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp共10条DNA片段溶于TE缓冲液中，将含有DNA的溶液与6×DNA上样缓冲液以5:1的比例配制、混匀，使500bp、1000bp、1500bp条带的终浓度为80ng/μL，其余条带的终浓度为40ng/μL；或将500bp、800bp、1000bp、1300bp、1500bp、2200bp共6条DNA片段溶于TE缓冲液中，将含有DNA的溶液与6×DNA上样缓冲液以5:1的比例配制、混匀，使500bp、1000bp、1500bp条带的终浓度为80ng/μL，其余条带的终浓度为40ng/μL。