[发明专利]一株重组大肠杆菌及其在发酵生产2[4Fe4S]铁氧还蛋白中的应用

摘要

本发明公开了一株重组大肠杆菌，该菌株含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因，命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pET51b‑2[4Fe4S]Fd，是将2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因连接入pET51b载体，制得重组质粒命名为pET51b‑2[4Fe4S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli C41(DE3)中获得。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在发酵生产2[4Fe4S]铁氧还蛋白中的应用，实验证实每升发酵培养物最终可以获得3.5mg纯化后的2[4Fe4S]铁氧还蛋白，远大于从野生菌中纯化出来的0.5mg的产量，预示本发明提供的重组大肠杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。

主权项

1.一种利用重组大肠杆菌发酵生产2[4Fe4S]铁氧还蛋白的方法，步骤是：(1)构建重组大肠杆菌菌株，将重组大肠杆菌以体积比1～5％的接种量接种到含有抗生素和铁硫源的TB培养基中，在37±1℃和180±10rpm转速条件下培养2～3小时至OD_620nm为0.4～0.6，获得菌液；其中，上述重组大肠杆菌菌株是将来源于巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)DSM 525的2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因连接入pET51b载体，制得重组质粒命名为pET51b‑2[4Fe4S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli C41(DE3)中获得，该重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pET51b‑2[4Fe4S]Fd，其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的2[4Fe4S]铁氧还蛋白基因；上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone 12g/L，Yeast extract 24g/L，Glycerol 4ml/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L；上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终浓度为25μg/m的羧苄西林；上述铁硫源配方及组分终浓度是：柠檬酸铁铵0.2‑0.3g/L，L‑半胱氨酸0.1‑0.2g/L，柠檬酸铁0.18‑0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.25‑0.4g/L；(2)向制得的菌液中加入终浓度为0.5mM的IPTG，在16～37℃和180±10rpm转速下诱导2.5～24小时，收集培养液离心，获得含2[4Fe4S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细胞；(3)破碎细胞，分离纯化制备2[4Fe4S]铁氧还蛋白。