[发明专利]制备外源功能基因定点整合的人神经干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种制备外源功能基因定点整合的人神经干细胞的方法，所述细胞株为定点整合有外源功能基因，且能稳定表达外源功能基因的人神经干细胞株；通过构建一种高效表达外源功能基因的质粒载体，然后用此质粒包装的重组腺相关病毒(rAAV)和辅助定点整合的rAAV以一定比例共感染人神经干细胞，筛选获得外源功能基因定点整合于19号染色体AAVS1位点的人神经干细胞。本发明的基因工程化细胞株能够保持原有的干细胞特性；本发明的细胞株移植后能分化成神经元细胞，并且稳定表达外源功能基因，以纠正或补偿由于基因异常或缺陷所引起的疾病，或赋予细胞新的功能，为干细胞基因治疗提供一种可行的方法。

主权项

一种制备外源功能基因定点整合的人神经干细胞的方法，通过以下步骤制得，包括：步骤1，外源功能基因的获得：根据外源功能基因序列设计引物，将所述引物进行PCR扩增，将PCR产物连接至克隆载体构建外源功能基因克隆载体，对所述外源功能基因克隆载体进行测序，测序正确后对所述外源功能基因DNA片段进行扩增；步骤2，外源功能基因的质粒载体构建：将步骤1扩增后的外源功能基因克隆载体及rAAV2骨架质粒分别进行双酶切，在紫外透照仪上回收外源功能基因片段和质粒载体骨架片段，所述外源功能基因片段及所述质粒载体骨架片段在连接酶作用下进行连接反应得到连接产物，对连接产物进行筛选鉴定，获得含有外源功能基因的rAAV2质粒载体；步骤3，含有外源功能基因的重组腺相关病毒及定点整合辅助腺相关病毒的制备：对步骤3得到的所述含有外源功能基因的rAAV2质粒载体与包装必需的辅助质粒进行共转染AAV293细胞，得到含有外源功能基因的重组腺相关病毒及定点整合辅助的腺相关病毒；步骤4，外源功能基因定点整合的人神经干细胞的制备及定点整合鉴定：将步骤3制得的含有外源功能基因的重组腺相关病毒及定点整合辅助腺相关病毒以一定比例共感染人神经干细胞，利用流式细胞仪分选得到外源功能基因定点整合的人神经干细胞，利用巢式PCR鉴定外源功能基因定点整合于人神经干细胞19号染色体的AAVS1位点；以及，步骤5，对所述外源功能基因定点整合的人神经干细胞进行功能鉴定：对筛选出的人神经干细胞的干细胞特性、外源功能基因表达及分化能力进行分析鉴定。