[发明专利]一种动物软骨源的未变性II型胶原及其制备方法

摘要

本发明公开了一种动物软骨源的未变性II型胶原的制备方法，其特点是以新鲜可溯源的动物软骨为原料，通过反复冻融、超声脱脂、高渗液脱细胞、酸碱软化等工艺对软骨进行纯化处理，再通过盐酸胍除糖、浸酸、复合酶处理、多次盐析、多次离心纯化、膜透析、冷冻干燥等工艺，得到海绵状未变性II型胶原。通过该方法得到的高纯度、高产率的II型胶原，保留了胶原完整的三股螺旋结构，生物活性高，结构稳定易于保存，有利于软骨细胞的黏附、生长、增殖，可用于医用生物材料的制备。

主权项

一种动物软骨源的未变性II型胶原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：所述原料份数按重量计（1）动物软骨的前处理：取新鲜可溯源的动物软骨100～200份，用剪刀手工清除残留骨头、肌肉，接着在不锈钢转鼓中用生理盐水反复清洗3～5次，沥水30～60min；将动物软骨放入‑40～‑80℃的速冻冰箱中反复冻融5～10次，接着将其浸泡在1000～10000体积份的脱脂剂中，伴随间歇性功率为 50～100W 超声波，每作用30～60min 停 10‑30min，反复作用 3～5次，中途换液 2～5 次，用0.05M Tris，1M NaCl，pH为7.5 的Tris‑NaCl缓冲溶液清洗3～5次，再将其浸泡在2～3.5M NaCl，20～40mM EDTA的高渗溶液中，37℃下搅拌10～20h，沥水30～60min；将动物软骨继续浸泡在 pH2.0～2.5，1000～5000体积份的醋酸溶液2～10h，纱布过滤回收醋酸溶液，去离子水清洗3～5次，用0.1～1M，1000～5000体积份的NaOH溶液软化处理 10‑24h，去离子水清洗3～5次，冷冻干燥，得到纯化的动物软骨；将动物软骨采用低温超微粉碎机粉碎，干燥器中保存待用；（2）未变性II型胶原的提取：将100～200份动物软骨粉浸泡在1000～2000体积份含有4M盐酸胍的0.05M Tris，1M NaCl，pH为7.5 的Tris‑NaCl缓冲溶液中，室温下搅拌10～36h，接着10000～20000rpm离心10～30min，回收上清液，用去离子水反复清洗沉淀物，将沉淀物浸泡在 pH2.0～2.5，3000～10000体积份的醋酸溶液，在恒温4～10℃下缓慢搅拌3～10h，接着加入1～4份复合酶， 4～10℃下转动24～72h，得到酶溶动物软骨II型胶原溶液 ；（3）未变性II型胶原的纯化：向上述所得到的动物软骨II型胶原溶液中加入最终浓度为0.9mol/L的氯化钠粉末，4～10℃下搅拌10～16h，10000～20000rpm离心10～30min，弃上层清液，将沉淀物再次溶于0.1～0.5mol/L醋酸溶液，用5～10M NaOH溶液调节pH值为6.5～7.5，加入最终浓度为4mol/L的氯化钠粉末，4～10℃下搅拌10～16h，接着10000～20000rpm离心10～30min，弃上层清液，将沉淀物再次溶于0.1～0.5mol/L醋酸溶液，再用5～10M NaOH溶液调节pH值为6.5～7.5，加入最终浓度为4mol/L的氯化钠粉末，4～10℃下搅拌10～16h，再次以10000～20000rpm离心10～30min，取下层沉淀物，如此反复盐析3～5次；将盐析后得到的沉淀再溶于0.1～0.5mol/L醋酸溶液，以浓度为 0.1～0.5M的乙酸溶液为透析液透析处理 2‑3 天，冻干，得到海绵状未变性的动物软骨II型胶原；所制得的动物软骨II型胶原，其关键性能达到如下指标要求：    外观：白色海绵状，无肉眼可见之杂质和变色；    色氨酸分析：应不含有色氨酸；    重金属含量：≤10μg/g(m/m)；    羟脯氨酸含量：应不小于总蛋白含量的8.5%(m/m)；    脂质体：≤1%(m/m)；    灰分：≤2%(m/m)；    杂蛋白含量：≤1%(m/m)；    细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；    无菌试验：无菌；    致敏试验：无迟发性超敏反应；    皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4。