[发明专利]检测SCA致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒

摘要

本申请公开了一种检测SCA致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒，所述检测方法包括：样本处理，DNA提取，PCR扩增，PCR产物电泳，PCR产物纯化，测序。所述引物序列如：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述试剂盒包括有上述引物。本发明的优点是：解决了现有技术中进行SCA致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。

主权项

一种检测SCA致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；DNA提取，取220μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：1)加220μL Buffer BL，震荡混合，于70℃孵育10min；2)加220μL无水乙醇震荡混合约20秒；3)12000rpm离心1min；4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2min；5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μL HB solution，室温放置5min；6)12000rpm离心2min；7)加入700μL wash Buffer，12000rpm离心2min；8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μL wash Buffer，12000rpm离心2min；9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μL 70℃预热的洗脱液,室温放置1‑2min，12000rpm离心2min，滤液即为模板DNA；PCR扩增PCR反应体系：10×PCR Buffer 2μL；HotStarTaq DNA Polymerase  按kit标准调整；dent mix 2μL；上游引物PrimerU 1μ1；下游引物Primer L 1μL；DNA模板  xμL；灭菌蒸馏水  20μL‑‑‑上述总体积；PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；PCR产物纯化每管内加入100μL PCR‑A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；弃收集管内液体，加入700μL washing buffer，12000rpm离心2min；弃收集管内液体，加入400μL washing buffer，12000rpm离心2min；弃收集管内液体，12000rpm离心2min；柱内加入30μL 70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；测序反应反应体系：0.8μL BigDye+1.5μL BigDye Seq Buffer+3μL引物+1μL PCR纯化产物+3.5μL ddH₂O；测序PCR热循环条件：1)变性的条件，96℃10sec；2)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；3)延伸的条件，60℃4min；4)4℃保温；每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；测序产物纯化10μL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；1)每管加入100μL 100％酒精，或每管加入1μL 125mM EDTA到管底，或每管加入1μL 3M NaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；3)每管加入100μL 70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；4)室温挥发净酒精，加入10μL Hi‑Di Formamide溶解DNA；5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；6)测序纯化：使用ABI Bigdye XTerminator purification kit；PCR检测，包括：1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；在SCA基因突变位点两端设计三对特异性引物；所述引物是SCA 1、SCA 2和SCA 3，所述引物SCA 1的sense为：5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC 3'，所述引物SCA 1的antisense为：5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG 3'，所述引物SCA 2的sense为：5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT 3'，所述引物SCA 2的antisense为：5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC 3'，所述引物SCA 3的sense为：5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC 3'，所述引物SCA 3的antisense为：5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG 3'；所述引物PCR扩增出目的片段模板；所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万‑10万倍，终浓度为10‑20ng/μL，作为检测阴性对照用；2)25μL反应体系检测：混合均匀；所有样本混合完后，将ABI Veriti Dx PCR系统仪器中进行程序性检测；结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。