[发明专利]一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂及其制备方法，本发明的制剂由间充质干细胞、表皮生长因子、人血白蛋白、细胞因子白介素11和生理盐水按照一定的比例制成。本发明公开的制备方法，来源丰富，取材方便，制作简单，细胞移植后免疫排斥低；本发明首次将间充质干细胞联合细胞因子使用，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗系统性红斑狼疮的方法。

主权项

一种治疗系统性红斑狼疮的干细胞制剂，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）胚胎干细胞的体外培养、扩增：采用胚胎干细胞的培养液将胚胎干细胞重悬后，调整细胞密度为（1～3）×10⁴/cm²，接种于明胶包被的T175细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO ₂培养箱中孵育，48小时后补液，72小时后换液；待细胞融合到85～90%时用0.25%的胰蛋白酶消化传代，按照1：3～1：5传代到100mm培养皿中，补足培养液继续培养，每2～3d用消化液消化传代；（2）诱导胚胎干细胞向间充质干细胞分化、培养、传代和检测：将步骤（1）中所得胚胎干细胞的细胞浓度调整为5×10⁵/皿接种到100mm培养皿中，每皿加入诱导体系8ml，将培养皿置于37℃、5%CO ₂进行诱导培养24h；将经过诱导生后的干细胞更换培养液，采用间充质干细胞培养液，待细胞长满后用0.25%胰蛋白酶消化传代，扩大培养至干细胞数为10⁸‑10⁹；用流式细胞仪对P3代诱导后的间充质干细胞进行鉴定：所述间充质干细胞表达CD73、CD90、CD105和CD29，不表达 CD34和CD14；（3）将步骤（2）制备的间充质干细胞与表皮生长因子（EGF） 、白介素11（IL‑11）、人血白蛋白按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成干细胞制剂；其中，所述步骤（1）中的胚胎干细胞培养液的组成为：90%DMEM培养基，10%胎牛血清、0.1 mmol/Lβ‑巯基乙醇、1mmol/L L‑谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，4ng/ml重组人碱性成纤维生长因子；所述步骤（2）中的诱导体系为：含10%胎牛血清、100ng/mL ActivinA的去除LIF、2mmol/L L‑谷氨酰胺、10μmol/L Y‑27632(Rho激酶抑制剂)的DMEM (高糖)培养基；所述步骤（2）中间充质干细胞培养液的组成为：15%胎牛血清（FBS），85%DMEM培养液；所述步骤（3）中干细胞制剂的具体组成为：间充质干细胞的浓度为（4～6）×10⁷个/ml， EGF为8ng/mL，人血白蛋白的质量体积比为2%，IL‑11为30ng/mL，余量为生理盐水。