[发明专利]一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法

摘要

本发明提供一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，是一种利用微积分分段拟合，定量评价在微生物存在条件下氨基酸对植物生长的营养贡献的方法。本发明采用碳氮双标记技术结合微积分原理，在考虑到微生物影响的环境下研究氨基酸对植物生长的长期营养贡献，为研究有机营养提供了方法基础。本方法操作简单，培养环境易调控，采用同位素技术数据精确可靠，具有较高的精确度，可以研究多种植物的氨基酸营养贡献，为养分资源高效管理提供了理论与技术支撑。

主权项

一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，通过以下步骤实现：(1)土壤准备：采集试验点0‑15cm表层土壤，过4mm筛，阴凉通风处自然风干后过2mm筛，装袋备用；(2)植物种植：取上述制备好的土壤2000g于口径分别为17cm、12.5cm的塑料盆中，该塑料盆底部不含透水孔，在土体中均匀插入5‑10根聚乙烯管，将已经发芽的玉米种子种植在塑料盆中心，待玉米长到2cm高时，挑选生长一致的玉米苗备用；其特征在于，(3)第一次添加标记物：待挑选后的玉米苗再发芽1‑2d后，选择三盆，向盆内每个聚乙烯管中添加含0.001‑0.00001mmolL‑1、标记丰度为99.8％的13C，15N‑Glycine溶液20ml，每盆共加100‑200ml，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100‑200ml；(4)样品收集：在添加标记物的塑料盆中的玉米吸收4h后，尽快破坏性采样，将土壤与根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL‑1氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01molL‑1硫酸滴定，测定植株不同部位的15N丰度值，采集植物样品的同时，将新鲜的土壤迅速收集起来，放入4℃冰箱中保存，待试验所有土壤样品收集完成后，测定土壤鲜样中水溶性氨基酸的含量；(5)第二次添加标记物：第一次添加标记物及超纯水3d后，进行第二次添加标记物，向每个聚乙烯管中添加含0.001‑0.00001mmolL‑1的13C，15N‑甘氨酸溶液20ml，每盆共加100‑200ml，共加三盆，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100‑200ml，添加标记物的塑料盆，待玉米苗吸收4h后，采用步骤(4)收集样品；(6)每隔三天重复步骤(3)和(4)，共采集植物样品15‑25次；(7)确定植物吸收分子态氨基酸：以15N吸收量为横坐标，以13C吸收量为纵坐标，两者进行线性拟合，得到13Cexcess＝a15Nexcess‑b，如果植物吸收的氨基酸均为分子态氨基酸，则a＝2，根据实际试验得到a，与理论值2进行比较，就可以得到吸收的分子态氨基酸的比例；(8)确定土壤中分子态氨基酸吸收速率：Nrate=NTotal‑NAsAfCSOILCb*T]]>Nrate指的是土壤游离氨基酸的吸收速率，NTotal‑N指的是每盆采集的植物样品的含氮量，As指的是在植物样品中由步骤(7)确定的植物吸收分子态氨基酸的氮量，Af标记物质的15N丰度，其中甘氨酸99 .8％；CSOIL指的是土壤中游离氨基酸的浓度；Cb指的是添加到土壤中的标记氨基酸浓度；T指的是植物吸收的时间；(9)确定氨基酸在整个植物生长期营养贡献：由步骤(8)确定各采样时间点土壤中分子态氨基酸吸收速率后，以培养时间为横坐标，以吸收速率为纵坐标，采用微积分的方法确定氨基酸在整个植物生长期的营养贡献，吸收速率曲线与种植时间所形成的面积则为总的氨基酸吸收量；采用以下公式拟合分子态氨基酸的吸收总量：N吸收量(g)＝{(Nrate1+Nrate2)/2*72+(Nrate2+Nrate3)/2*72+,,,+(Nraten‑1+Nraten)/2*72}*14/1000000Nrate指的是某次取样时分子态氨基酸的吸收速率，由步骤(8)确定，Nrate1则为第一次取样时分子态氨基酸的吸收速率；步骤(2)所述的聚乙烯管为中空的且外壁上布满小孔的聚乙烯管。