[发明专利]促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用

摘要

本发明公开了促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用，包括采集健康的牙齿、牙髓分离、牙髓干细胞DPSC培养、传代培养、缺氧处理，缺氧处理后进行RealTime-PCR和Western Blot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。本发明通过对原代培养DPSC进行缺氧预处理，有效提高其成骨及成血管基因的表达效应，能够显著提高成体干细胞移植修复根尖周炎骨缺损的疗效。

主权项

促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，该方法包括：步骤一、选取临床上8～14岁因正畸治疗需要拔除的健康、完整的前磨牙，拔出后立即放入预冷的α‑MEM培养液中保存30分钟，α‑MEM培养液含2％双抗；步骤二、在无菌条件下劈开牙冠及牙根，用无菌镊子和探针取出牙髓组织，放在事先准备好的无菌EP管中，用含2％双抗的PBS润洗牙髓组织3遍后，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成0.5～1.0mm³的小块；步骤三、往处理后的牙髓组织块中加入配好的含1％Ⅰ型胶原酶的消化液，来回颠倒EP管，使组织块充分浸到消化液中，将EP管放37℃恒温箱中消化3小时，其中每隔半小时颠倒EP管一次；步骤四、用同等体积的含10％胎牛血清的α‑MEM培养液终止消化，低速离心，弃上清；用含30％胎牛血清的完全培养液重悬沉淀，转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的常规培养箱中培养；步骤五、培养7‑10天后，观察到贴壁细胞形成多个克隆，用胰酶消化收集细胞克隆，继续DPSC传代培养，选用传代培养的第三代DPSC，第三代DPSC为纺锤状细胞，流式鉴定检测结果显示DPSC高表达间充质干细胞标志物STRO‑1、CD90、CD105和CD146，低表达或不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和CD14；步骤六、在常规培养箱中培养第三代DPSC，待细胞密度达到80％‑90％后，放入O₂浓度为3％的缺氧培养箱培养，缺氧时间为12‑24小时；用胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗后重悬细胞，即得缺氧DPSC；缺氧处理后进行RealTime‑PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。