[发明专利]一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法

摘要

本发明公开了一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法。本发明提供了一种将外源DNA分子利用CRISPR/Cas9同源重组到待编辑DNA片段的试剂盒，包括同源重组DNA片段或表达所述同源重组DNA片段的表达盒或重组载体、CRISPR/Cas 9系统或表达CRISPR/Cas 9系统的表达盒或重组载体；所述CRISPR/Cas 9系统包括SgRNA和Cas 9或Cas 9的mRNA。本发明方法涉及对sgRNA识别序列的选择、对同源臂载体上特定位点进行修饰和使用Gibson assembly方法快速构建载体，在使用CRISPR/Cas9技术建立转基因动物模型过程中，具有广泛的用途。

主权项

一种用于将外源DNA分子同源重组到待编辑位置的试剂盒，包括同源重组DNA片段或表达所述同源重组DNA片段的表达盒或重组载体、CRISPR/Cas 9系统或表达CRISPR/Cas 9系统的表达盒或重组载体；所述CRISPR/Cas 9系统包括SgRNA和Cas 9或Cas 9的mRNA；所述CRISPR/Cas 9系统针对的靶标序列包括待编辑位置、PAM和位于PAM上游的SgRNA识别区；所述同源重组DNA依次由上游同源臂、外源DNA分子和下游同源臂顺次连接构成；所述上游同源臂上含有对应SgRNA识别区的序列和对应于PAM的序列，或，所述下游同源臂上含有对应SgRNA识别区的序列和对应于PAM的序列；所述上游同源臂和下游同源臂上还含有或不含有片段X，所述片段X对应于靶标序列上的非PAM的其它NGG或NAG，且与所述对应于PAM的序列间隔8个核苷酸，且位于所述对应于PAM的序列的上游；所述上游同源臂上和所述下游同源臂上的对应于所述PAM的序列为所述PAM的同义密码子，所述对应SgRNA识别区的序列为所述对应于PAM的序列上游20个核苷酸序列；所述上游同源臂和所述下游同源臂上的所述片段X的序列为NGG或NAG的同义密码子；所述PAM的序列为NGG或NAG；所述NGG和NAG中，N为A、T、C、G四种中任一种。