[发明专利]一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法

摘要

本发明属于药物治疗肿瘤技术领域，涉及一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法，先在肿瘤细胞中加入U0126工作液后，再加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后检测细胞凋亡情况；或将肿瘤细胞加入小干扰RNA工作液后再加入肿瘤细胞培养基，然后加入齐墩果酸工作液，36小时后检测细胞凋亡情况；其选择的工艺路线合理，用药组合科学，诱导凋亡的条件易实现，效果明显，测定技术工艺成熟，应用前景良好。

主权项

一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法，其特征在于具体工艺步骤包括：(1)肿瘤细胞培养：将肺腺癌A549和PANC‑1胰腺癌细胞在胎牛血清体积比为10％的RPMI 1640肿瘤细胞培养基中，在CO₂体积百分比为5％的湿润37℃条件下进行培养；(2)化学试剂和小干扰RNA的获得：使用步骤(1)中的肿瘤细胞培养基将齐墩果酸稀释至终浓度为200微克/毫升得到齐墩果酸工作液；使用步骤(1)中的肿瘤细胞培养基将ERK抑制剂U0126稀释至终浓度为10微摩尔/毫升得到U0126工作液；将3微升靶向ERK的小干扰RNA母液加入150微升Opti‑MEM培养基，同时再将9微升小干扰RNA转染试剂加入150微升Opti‑MEM培养基，将两者混合后室温环境下放置5分钟得到小干扰RNA工作液；(3)齐墩果酸联合ERK通路抑制剂：齐墩果酸联合ERK通路抑制剂包括齐墩果酸联合U0126和齐墩果酸联合ERK小干扰RNA两种方案，其中齐墩果酸联合U0126方案是按照步骤(1)的条件培养肿瘤细胞24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤(2)中的U0126工作液，1小时后，加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情况；齐墩果酸联合ERK小干扰RNA是按照步骤(1)的条件将0.25×10⁶个肿瘤细胞在6孔板中培养24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤(2)中的小干扰RNA工作液；6小时后弃去培养基，加入步骤(1)的肿瘤细胞培养基，36小时后，加入与小干扰RNA工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情况；(4)细胞凋亡状况检测：采用免疫印迹法检测细胞凋亡状况时，使用M‑PER哺乳动物蛋白提取试剂从细胞中提取总蛋白，在重量百分比浓度为10‑12％的SDS‑PAGE上分离，然后转移到0.45微米孔径的硝酸纤维素膜上；再将所得的膜使用重量百分比浓度5％的BSA孵育1小时，然后使用一抗在湿润的4℃条件下孵育12‑16小时；最后用二抗识别结合的一抗，以SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate作为底物对目标蛋白质的条带显影；采用流式细胞方法检测细胞凋亡状况时，先进行流式细胞术分析，确定凋亡细胞的百分比，具体方法为加入质量百分比浓度为70％乙醇水溶液放置1小时，10毫克/毫升RNA酶A在37℃消化1小时，然后使用浓度为200毫克/毫升碘化丙啶染色，最后通过流式细胞术分析对每个样品进行1×10⁵个细胞计数，得到凋亡细胞的数目和比例；其检测结果显示，抑制ERK途径能够增强齐墩果酸的抗肿瘤活性，促进肿瘤细胞凋亡将齐墩果酸联合ERK抑制剂用药，显著增加肿瘤细胞的凋亡水平；在A549肺癌细胞中，齐墩果酸联合U0126使细胞凋亡率上升50％；齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升25％；在PANC‑1细胞中，齐墩果酸联合U0126使细胞凋亡率上升25％；齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升30％。