[发明专利]毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法

摘要

毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，本发明涉及悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立的方法。本发明的目的是为了解决现有技术对毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系建立研究空白的问题，为利用该体系生产药用有效成分提供技术基础。本发明的毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法按以下步骤进行：一、毛脉酸模悬浮细胞的制备；二、马铃薯固体培养基(PDA)的制备；三、毛脉酸模内生真菌RGT‑S4的活化及其孢子悬浮液的制备；四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌RGT‑S4的共培养体系；完成毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌的共培养。该共生体系的建立能够为植物与内生真菌互作机制的研究提供依据和基础。

主权项

1.毛脉酸模悬浮细胞与其内生真菌共培养体系建立的方法，其特征在于：该共培养体系建立的方法按以下步骤进行：一、毛脉酸模悬浮细胞的制备：选取颗粒饱满的毛脉酸模种子，用110目～130目砂纸磨去种皮，将去除种皮的毛脉酸模种子浸泡在蒸馏水中18h～26h；然后在无菌条件下用体积分数为70％～75％的酒精浸泡1min～3min，无菌水冲洗3次～5次；再用质量分数为8％～10％NaClO浸泡6min～10min，无菌水冲洗3次～5次，之后将去除种皮的毛脉酸模种子置于两层湿润的滤纸上8h～10h，获得吸水膨胀的毛脉酸模种子；用质量分数为8％～10％NaClO浸泡吸水膨胀的毛脉酸模种子8min～12min，无菌水冲洗3次～5次，得消毒的种子；将消毒的种子接种在不含植物生长激素的MS固体培养基中，置于光照培养箱内培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～8d；获得毛脉酸模无菌苗；利用含有植物激素的MS固体培养基对毛脉酸模无菌苗的下胚轴进行诱导，诱导出愈伤组织；选取生长良好的愈伤组织，接种在含有植物激素的MS固体培养基中，培养温度23℃～27℃，光照12h/d～16h/d，光照强度1500Lx～2000Lx，获得诱导的疏松愈伤组织；将获得诱导的疏松愈伤组织继代培养2次～3次，用无菌镊子夹碎，接种在装有30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基的容器中，培养温度23℃～27℃，100r/min～160r/min黑暗振荡培养；5d～8d后用60目～80目细胞筛去除大的细胞团块；将细胞悬浮培养物摇匀，稍静止，倒出上层培养液，向容器里注入新的含有植物激素的MS液体培养基，继续培养，可得到毛脉酸模悬浮细胞；二、马铃薯固体培养基的制备：取去皮马铃薯180g～220g，切块，加蒸馏水700mL～1000mL，煮沸15min～30min，6层～8层纱布过滤，将滤液倒入容器中，然后向容器里加入18g～20g葡萄糖和15g～20g琼脂，再加入蒸馏水至800mL～1000mL；分装，121℃灭菌20min～30min，得马铃薯固培养基；三、毛脉酸模内生真菌的活化及其孢子悬浮液的制备：将内生真菌接到步骤二制备的马铃薯固体培养基中进行活化培养，即在电热恒温培养箱中培养，培养温度24℃～26℃，培养3d～5d完成活化；然后在超净工作台内，取3mL～6mL无菌水加入活化培养的毛脉酸模内真生菌的容器中，震荡，接种环刮去孢子，用滴管吸取孢子液，通过无菌的两层擦镜纸过滤到容器中，重复此操作4次～8次，使用无菌水的总体积为25mL～35mL；充分震荡混匀，制得孢子悬浮液；其中容器里加入5粒～8粒直径为3mm～4mm的玻璃珠；四、建立毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌的共培养体系：向容器内加入30mL～50mL含有植物激素的MS液体培养基，培养毛脉酸模悬浮细胞，毛脉酸模悬浮细胞初始接入量为0.2×103个/mL，培养8d～10d后，接入内生真菌的孢子悬浮液，使其孢子在整个培养体系中的浓度达到0.2×103个/mL，将容器置于摇床上黑暗振荡培养，摇床转速为100r/min～160r/min，培养温度24.5℃～25.5℃，完成毛脉酸模悬浮细胞与内生真菌共培养体系的建立；所述诱导出愈伤组织的含有植物激素的MS固体培养基为添加3％～5％蔗糖，0.8％～1.0％琼脂粉、激素2,4‑二氯苯氧乙酸1.5mg/L～3mg/L和6‑苄氨基腺嘌呤2.8mg/L～3.2mg/L的MS培养基；所述获得诱导的疏松愈伤组织的含有植物激素的MS固体培养基为添加3％～5％蔗糖，0.8％～1.0％琼脂粉、2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/L～1.0mg/L和6‑苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS培养基；所述含有植物激素的MS液体培养基为添加3％～5％蔗糖、2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/～1.0mg/L和6‑苄氨基腺嘌呤2.5mg/L～3.0mg/L的MS液体培养基。