[发明专利]一种检测蓝藻DNA损伤的定量PCR试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种检测蓝藻DNA损伤的定量PCR试剂盒及应用，普通PCR反应液I包含针对聚球藻anl50基因设计的一对特异性引物，普通PCR反应液II包含针对聚球藻CDS:ABB57481.1基因设计的一对引物，定量PCR反应液I包含针对聚球anl50基因设计的一对特异性引物，定量PCR反应液II中包含针对聚球藻CDS:ABB57481.1基因设计的一对引物，其中扩增anl50基因的普通PCR上游引物与该基因的结合位置在其定量PCR上游引物与基因结合位置的上游，anl50基因的普通PCR下游引物基因的结合位置在其定量PCR下游引物与基因结合位置的下游。该试剂盒灵敏度和特异性高，检测方法简便、快速，实验结果可靠。适用于蓝藻质粒DNA拷贝数检测和蓝藻DNA损伤的定量检测，对于预测蓝藻水华的爆发和消亡具有实际的应用价值。

主权项

1.一种定量检测蓝藻细胞DNA损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用基因组DNA提取试剂盒对蓝藻总DNA进行提取；2)蓝藻总DNA分别加入普通PCR反应液I和普通PCR反应液II，用PCR检测仪分别对anl50基因片段和CDS:ABB57481.1基因片段进行扩增；所述的普通PCR反应液I包括扩增聚球藻anl50基因的引物对，2x PCR Reagent和无菌的超纯水；所述的普通PCR反应液II包括扩增聚球藻CDS:ABB57481.1基因的PCR的引物对，2x PCR Reagent和无菌的超纯水；3)将PCR产物进行纯化回收，Nanodrop进行浓度测定，按照公式：拷贝数/mL＝(6.02×1023拷贝数/mol)×[浓度(g/mL)/分子量(g/mol)]计算出纯化DNA的拷贝数，将标准品I和标准品II按照10倍稀释法进行系列稀释；所述的标准品I是含有聚球藻anl50基因的1401个核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，标准品I用Nanodrop进行定量，储存浓度为105拷贝/μL、106拷贝/μL、107拷贝/μL、108拷贝/μL、109拷贝/μL 5个浓度梯度；所述的标准品II是含有聚球藻CDS:ABB57481.1基因的1414个核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，标准品II用Nanodrop进行定量，储存浓度为104拷贝/μL、105拷贝/μL、106拷贝/μL、107拷贝/μL、108拷贝/μL 5个浓度梯度；4)将标准品I和待测样品加入定量PCR反应液I，用于检测anl50基因；将标准品II和待测样品加入定量PCR反应液II，用于检测CDS:ABB57481.1基因，用定量PCR检测仪进行检测；所述的定量PCR反应液I是由anl50基因定量PCR引物对、2×real time PCR Mix和无菌水组成，anl50基因的定量PCR正向引物为SEQ ID NO：5，反向引物为SEQ ID NO：6；所述的定量PCR反应液II是由聚球藻CDS:ABB57481.1基因定量PCR引物对、2×real time PCR Mix和无菌水组成，聚球藻CDS:ABB57481.1基因的定量PCR正向引物为SEQ ID NO：7，反向引物为SEQ ID NO：8；5)通过比较待测样品和标准品的循环域值，比较不同构象DNA的定量PCR的扩增效率，表征蓝藻DNA损伤的水平，损伤的DNA由于发生了解螺旋，其定量PCR的扩增效率较高，比对照组细胞DNA的定量PCR循环阈值小。