[发明专利]以荧光指示剂结合流式细胞技术测量红细胞内游离镁离子浓度的方法

摘要

本发明提供一种以荧光指示剂结合流式细胞技术测量红细胞内游离镁离子浓度的方法，目的在于精准测量一种与大量生命活动息息相关的内源性金属离子——镁离子在红细胞内游离状态下的浓度水平(RBC[Mg²⁺]_i)。采用镁离子荧光探针结合流式细胞的技术，具有测量迅速实时，操作简单方便；样本采集通量高，测量结果精确稳定等优点。由本发明测量的RBC[Mg²⁺]_i可以有效表征饮食摄取匮乏、糖尿病和衰老过程中动物身体的镁流失；并能有效指征老年动物的记忆力水平，以及预测外源性镁补偿治疗老年动物记忆损伤的用药效果。用本发明测量出的RBC[Mg²⁺]_i，可能是一种潜在的临床生理指标，将为健康饮食结构的调理，疾病诊断和监控，以及个体化精准医疗用药提供参考标准。

主权项

以荧光指示剂结合流式细胞技术测量红细胞内游离镁离子浓度的方法，其特征在于：包括以下步骤：1】试剂准备：生理缓冲液，无菌，冷藏；镁盐；血液抗凝剂，冷藏；细胞膜透过性镁离子荧光指示剂，冷冻；助溶剂(Pluronic F‑127)，室温；钙镁离子载体，冷冻；2】取血：将血液抗凝剂加入EP管内,后取动物静脉血沿管壁加入EP管中，及时混匀，得到全血样品待用；3】样品处理和孵育：3.1】用汉克斯平衡液稀释镁盐至生理镁离子浓度，调节至生理PH值，制得工作液，放于室温备用；3.2】将步骤2】得到的全血样品用步骤3.1】制备的工作液稀释至红细胞浓度3～9×10⁹个/L左右，放于室温备用；3.3】将冷冻的镁离子荧光指示剂取出，手握至融化，向其中按体积比1:1.25加入助溶剂Pluronic F‑127混匀；然后在避光的条件下与工作液混合，并用漩涡振荡器混匀；3.4】在EP管中将3.2】稀释后的全血样品与步骤3.3】制得的含镁离子荧光指示剂的工作液混合均匀，后放入水浴，做第一次孵育，并每间隔6‑8分钟晃动EP管一次；3.5】孵育完成后，向EP管中加入工作液，摇晃重悬，后室温离心；3.6】用移液器取出上清液弃掉，向管底的红细胞沉淀加入工作液，轻摇EP管重悬；或用剪口的移液枪头吹吸重悬；3.7】再一次执行步骤3.6】；3.8】重悬后的红细胞放入水浴进行第二次孵育，使红细胞内的镁离子荧光指示剂与细胞内游离镁离子充分结合；3.9】第二次孵育完成后取出管子擦干，放入暗盒内等待测量荧光强度；4】建立红细胞内游离镁离子浓度标准曲线：4.1】用汉克斯平衡液与硫酸镁或氯化镁制备符合生理范围的镁离子浓度梯度溶液；4.2】将步骤3.9】得到的红细胞多份平行样本并用汉克斯平衡液洗，后与步骤4.1】制备的镁离子浓度梯度溶液混合，向各管中加入钙镁离子载体，使得红细胞内外的镁离子浓度平衡；4.3】37℃水浴1～3小时，取出后将管子擦干，放入暗盒内等待测量荧光强度；4.4】以镁离子浓度梯度溶液和对应样品的荧光强度建立标准曲线；5】用流式细胞仪测量样本的荧光强度值：将3.9】和4.3】步得到的样本注入流式细胞仪，在前向角/侧向角图像中选取红细胞象限，进一步在荧光强度直方图中选取荧光峰，读取其平均荧光强度值；6】将5】得到的的平均荧光强度值代入4.4】得到的标准曲线，计算样本细胞内游离镁离子浓度。