[发明专利]一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法

摘要

本发明公开了一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，选取黄姑鱼，采用三针法注射，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，然后滴在干净玻片上老化，制得老化的玻片；用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针；将老化的玻片在甲酰胺中变性，再用乙醇脱水制得已变性的玻片；将FISH探针变性；将变性的FISH探针加入到已变性的玻片上，恒温箱中杂交；再经放大、洗涤、信号检测即可。本发明提供一种简便方法能够使黄姑鱼染色体呈现特异的荧光分布特征，提高黄姑鱼染色体辨识的效率与准确性，解决黄姑鱼染色体辨识标志贫乏的问题。

主权项

1.一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤如下：一、染色体制备选取黄姑鱼，采用三针法注射；前两针按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.6‑1.0ml党参煎汁液和BSA的混合液，注射第一针15h后注射第二针；第三针是在取样前2.5h按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.08‑0.12ml秋水仙素；剖取黄姑鱼的头肾，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，制得细胞悬液，‑40℃保存；取细胞悬液，滴在干净玻片上，60℃老化2.5‑3.5h，制得老化的玻片；所述党参煎汁液和BSA的混合液是将50g党参煎熬至最终体积为50ml，再加入0.405g NaCl和125mg的BSA混匀后制得；二、提取黄姑鱼鳍条DNA用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；三、制备FISH探针用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针长度在200‑750bp之间；四、基因组荧光原位杂交1）玻片变性：将老化的玻片在现配的74℃的体积浓度为80%的甲酰胺中变性2.5min，再依次用质量浓度为70%、80%、90%、100%、100%的乙醇分别脱水，制得已变性的玻片；2）FISH探针变性：将制备好的FISH探针加入到杂交缓冲液HB中，使得终浓度为1.5‑2ng/μl，72℃变性8min，然后立即放置冰块上，制得变性的FISH探针；所述杂交缓冲液HB含有杂交基础缓冲液、去离子甲酰胺与50%硫酸葡聚糖；3）杂交：将变性的FISH探针加入到已变性的玻片上，用封口膜封上，于37℃恒温箱中杂交12‑16h；4）放大：杂交后取出，室温放置0.8‑1.2h后，依次使用体积浓度为10%的甲酰胺溶液、4×SSC、4×SSC各洗涤5min，室温晾干后加AV到玻片上有FISH探针的地方37℃孵育；其中，AV为4μg/ml的Avidin‑Alexa fluor‑488标记的兔抗亲和素；5）洗涤：孵育后取出，依次用2×T‑SSC、4×SSC、4×SSC暗处洗涤；6）信号检测：室温晾干后用碘化丙啶PI进行复染，指甲油封片，然后用荧光显微镜完成显微观察与拍照；通过绿色荧光滤片组观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的电荷藕合器件图像传感器拍摄图像，利用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。