[发明专利]一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法

摘要

本发明公开一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：采用肝细胞为种子细胞，以多孔蚕丝蛋白支架作为肝细胞体外培养载体，将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上，并将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养；该方法所建立的三维肝细胞共培养体系，不但可以用于组织工程化肝细胞功能单元，而且还可用于体外评价药物对肝代谢酶的影响及肝毒性检测，为新药研发提供新的筛选评价工具。

主权项

1.一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：采用肝细胞为种子细胞，以多孔蚕丝蛋白支架作为肝细胞体外培养载体，将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上，并将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养，所述的将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上的具体操作步骤如下：将新鲜分离的肝细胞和肝星形间质细胞按照细胞数3:1的比例混合，并将获得的混合细胞与细胞外基质混合，获得细胞‑基质混合物，所述的细胞外基质由胶原和基质胶按照体积比为1:1的比例混合而成，然后将细胞‑基质混合物多点接种至多个多孔蚕丝蛋白支架，并保证肝细胞数量为600,000cells/支架，基质胶的体积为30μL/支架，所述的将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养的具体操作步骤如下：将接种完成的多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5%CO2的条件下凝胶化2h，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入共培养基，所述的共培养基为肝细胞培养基和星形间质细胞培养基按照体积比为1:1的比例混合而成，所述的多孔蚕丝蛋白支架按照如下步骤制备：首先制备浓度为6‑7%的丝素蛋白溶液，采用盐析‑干燥法制备多孔丝素蛋白支架，通过盐颗粒大小控制支架孔径为500‑600 μm, 干燥后充分浸润于去离子水内，然后采用标准打孔器制备直径5mm，厚度3mm的三维支架，即多孔蚕丝蛋白支架，并且多孔蚕丝蛋白支架在接种细胞前需经高温高压灭菌处理，且浸泡在培养基内进行预平衡12 h。