[发明专利]一种刚地弓形虫虫株的分离方法

摘要

本发明公开了一种刚地弓形虫虫株的分离方法，包括以下步骤：A、弓形虫阳性动物样品的获得，B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得，C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，E、接种后昆明小鼠的阶段性护理，F、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测；本发明投入成本较低；能够有大范围高效地筛选弓形虫阳性动物样品；分离出新型弓形虫虫株的程序简单，效果显著，便于常规条件操作；能够更方便地为弓形虫疫苗研究提供新型弓形虫虫株；本发明采用胃蛋白酶消化的方法，可以接种50克或超过50克的组织；背部接种小鼠降低了小鼠的死亡率。

主权项

一种刚地弓形虫虫株的分离方法，包括以下步骤：A、弓形虫阳性动物样品的获得，B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得，C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，E、接种后昆明小鼠的阶段性护理，F、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测；其特征在于：A、弓形虫阳性动物样品的获得针对弓形虫病流行区域的动物进行采血，将采集的血液离心获得动物血清，采用弓形虫检测试剂对血清弓形虫抗体进行检测，将检测结果为阳性的动物个体标记为弓形虫抗体阳性动物，并摘取该阳性动物的心脏、肌肉、大脑，随机选取三个部位剪取心脏、肌肉、大脑，三部位总重至少为50克，即获得的弓形虫阳性动物心肌样品；B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得：（1）用剪刀将弓形虫阳性动物心肌剪碎；（2）弓形虫阳性动物心肌匀浆：将剪碎后的弓形虫阳性动物心肌置于匀浆机内，加入生理盐水匀浆后倒出匀浆液，再用生理盐水冲洗匀浆机，匀浆液和冲洗液合为一体为弓形虫阳性动物心肌匀浆液，并用广口瓶盛放并贴上标签，体积之比为：弓形虫阳性动物心肌 ：生理盐水=1 ：5；（3）胃蛋白酶消化：向弓形虫阳性动物心肌匀浆液内加入胃蛋白酶溶液，加入量按体积比为：弓形虫阳性动物心肌匀浆液：胃蛋白酶溶液=1：0.8—1；将加入胃蛋白酶溶液的弓形虫阳性动物心肌匀浆液置于37℃的恒温水浴摇床中1h；（4）过滤离心：将消化好的弓形虫阳性动物心肌匀浆液用一次性纱布过滤并分装，用常温低速离心机离心；（5）调PH：向（4）离心沉淀物中缓慢加入1.2%的碳酸氢钠酚红溶液并震荡，直至溶液颜色由红色变为橘黄色，此时PH接近中性；（6）加双抗：将（5）得到的橘黄色液体再次离心除去上清液，向沉淀中加入与沉淀等体积的青链霉素混合液，室温静置后即得弓形虫阳性动物心肌消化液；青链霉素混合液中，青霉素200U/ml,链霉素200ug/ml；C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液选取健康的昆明小鼠若干，并对每只小鼠进行耳标标记，每一只小鼠背部皮下接种1ml的得弓形虫阳性动物心肌消化液；D、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测接种后，五周内死亡的小鼠，采取常规剖检，摘取肺脏做组织研磨涂片镜检，若发现有香蕉状的弓形虫速殖子即判别为弓形虫阳性小鼠；五周内未死亡的小鼠采血获取血清，做弓形虫抗体检测，检测结果阳性的即判定为弓形虫阳性，同时五周内未死亡的小鼠做大脑压片，检测是否含有弓形虫包囊；E、弓形虫阳性昆明小鼠分离虫株的获得接种后，五周内死亡的小鼠，经肺部研磨涂片镜检发现香蕉状弓形虫速殖子的，将小鼠肺部研磨接种于细胞培养，采用Vero细胞，37℃,5%CO₂,连续培养21天，即可获得10⁵个弓形虫速殖子；五周后的小鼠经弓形虫抗体检测结果为阳性的，将其大脑或心脏研磨，将研磨液接种于细胞培养，用Vero细胞，37℃,5%CO₂,连续培养21天，即可获得10⁵个弓形虫速殖子。