[发明专利]一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法

摘要

本发明公开了一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法，包括材料的选取和消毒、悬浮培养诱导愈伤组织过程和继代筛选培养过程。本发明提供快速建立橡胶树悬浮细胞系的方法工艺流程简单，用时相对较短，只需60～90天即可建立一个稳定均匀、分散性良好、生长迅速的悬浮细胞系，比采用常规方法建立橡胶树悬浮细胞系花费的时间至少缩短一半以上，极大降低了生产成本，缩短了实验周期，可为批量体细胞胚同步诱导再生植株，或进行原生质体培养与体细胞杂交，以及利用原生质体为受体进行外源基因的直接转化等技术体系快速提供良好的材料来源。

主权项

一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法，其特征在于包括材料的选取和消毒、悬浮培养诱导愈伤组织过程和继代筛选培养过程；步骤如下：(1)材料的选取和消毒：选取橡胶树单核靠边期未成熟雄花蕾为起始材料，并采用75％酒精和0.1％氯化汞常规二次消毒的方法对其进行表面消毒；(2)悬浮培养诱导愈伤组织过程：在超净工作台上用镊子和解剖针完整剥出上述消毒花蕾中的花药，将50～100粒花药接种于含15～30ml液体培养基的三角瓶中，置于80～100rpm摇床上，温度为26～28℃条件下暗培养30～40天，期间更新1～2次液体培养基；所述液体培养基的成分为：改良的MS基本培养基、0.1～1mg·L^‑16‑BA、0.2～2mg·L^‑1NAA、1～3mg·L^‑12,4‑D、0.1～1.0mg·L^‑1TDZ、0.1～5mg·L^‑1AgNO₃、60～80ml·L^‑1椰子水和40～50g·L^‑1蔗糖；所述改良的MS基本培养基中的改良成分为：MgSO₄·7H₂O 550mg·L^‑1、KH₂PO₄420mg·L^‑1、CaCl₂260mg·L^‑1、MnSO₄·H₂O 30mg·L^‑1、CuSO₄·5H₂O 0.25mg·L^‑1；(3)继代筛选培养过程：在花药悬浮培养长出愈伤组织后每5‑7天用与步骤(2)相同的液体培养基进行继代培养1次，并筛除老化和褐化的组织，持续继代培养20～30天游离出小细胞团后，吸取适量的小细胞团按细胞团占液体体积3％～6％的比例添加新的液体培养基继续继代培养1～3次，即获得稳定分散的悬浮细胞系。