[发明专利]一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法

摘要

本发明公开了一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法，首先，利用磁性捕获基底和拉曼探针通过免疫反应识别样品中的外泌体，形成磁性捕获基底‑外泌体‑拉曼探针形式的三明治结构；然后，利用外加磁场分离收集产物；最后，利用共聚焦拉曼显微系统分析产物中的SERS信号，SERS信号越强则表明外泌体浓度越高。本发明将SERS技术运用到外泌体检测中，采用SERS技术对样品进行精确的定性以及定量分析，可实现快速高灵敏的外泌体检测。

主权项

1.一种通过SERS信号快速检测外泌体的方法，其特征在于：首先，利用磁性捕获基底和拉曼探针通过免疫反应识别样品中的外泌体，形成磁性捕获基底‑外泌体‑拉曼探针形式的三明治结构；然后，利用外加磁场分离收集产物；最后，利用共聚焦拉曼显微系统分析产物中的SERS信号，SERS信号越强则表明外泌体浓度越高；所述磁性捕获基底为核壳结构，包括内核层和外壳层，内核层为四氧化三铁纳米粒子，外壳层为二氧化硅壳层，在二氧化硅壳层外表面修饰氨基，二氧化硅壳层通过氨基连接外泌体特异性抗体A；所述拉曼探针为核壳结构，包括内核层和外壳层，内核层为金纳米粒子，外壳层为二氧化硅壳层，在金纳米粒子外表面连接有拉曼分子，二氧化硅壳层将拉曼分子和金纳米粒子包裹在内，在二氧化硅壳层外表面修饰氨基，二氧化硅壳层通过氨基连接外泌体特异性抗体B；所述四氧化三铁纳米粒子采用溶剂热法制备，所述二氧化硅壳层采用改进的法制备，所述外泌体特异性抗体A是能与外泌体表面的蛋白A’发生免疫识别的特异性抗体；所述拉曼分子为含巯基的有机分子，拉曼分子通过巯基共价地连接到金纳米粒子外表面；所述金纳米粒子采用柠檬酸钠热还原法制备，所述二氧化硅壳层采用改进的法制备，所述外泌体特异性抗体B是能与外泌体表面的蛋白B’发生免疫识别的特异性抗体；所述外泌体特异性抗体A和外泌体特异性抗体B是两种不同的外泌体特异性抗体，通过外泌体特异性抗体A和外泌体特异性抗体B能分别识别外泌体表面同时表达的两种不同蛋白；具体包括如下步骤：步骤一、采用溶剂热法制备四氧化三铁纳米粒子在80mL乙二醇中加入2.7g六水合氯化铁、1g聚乙二醇和3.6g醋酸钠，搅拌半小时使之充分混合均匀；随后将该混合溶液装入聚四氟乙烯反应釜中200℃反应8小时，产物用磁性分离并用去离子水反复清洗，即得到三氯化铁纳米粒子；将三氯化铁纳米粒子分散至50mL去离子水中，用氩气驱赶溶液中的氧气后，密封4℃保存待用；步骤二、采用改进的法包裹在四氧化三铁纳米粒子表面包裹二氧化硅取400μL步骤一中得到的四氧化三铁纳米粒子溶液，分散至10mL 50mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，将混合液超声20min后振荡12h，用磁铁收集包裹了PVP的四氧化三铁纳米粒子，并将其分散至10mL含1.25％质量分数氨水的酒精中，加入10μL正硅酸四乙酯后振荡10h，使二氧化硅逐渐生长至四氧化三铁纳米粒子表面；用磁铁收集包裹了二氧化硅的四氧化三铁纳米粒子，并用酒精反复清洗，随后将二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子分散至10mL酒精中，加入400μL 3‑氨丙基三甲氧基硅烷和100μL去离子水，振荡12h后将该混合液置于70℃水浴中加热2h；用磁铁收集反应产物即得表面修饰了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子，最后将该产物分散至2mL酒精中；步骤三，在步骤二中得到的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子表面连接抗体A，得到磁性捕获基底；所述抗体A为rabbit anti‑CD63取100μL步骤二中得到的修饰了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三铁纳米粒子，磁铁分离，弃除上清并将分离产物分散至500μL的去离子水中，加入5μL50％的戊二醛，室温振荡1小时后磁铁分离，水洗2次后将沉淀分离至500μL的去离子水中；加入5μL1mg/mL的rabbit anti‑CD63，室温振荡3小时后磁铁分离，并用PBS缓冲液清洗一次，将沉淀分散至500μL的PBS中；再加入50μL1％的BSA反应1小时后磁铁分离，沉淀分散至500μL的PBS中，4℃保存；步骤四，制备球形金纳米粒子在200mL去离子水中加入200μL质量分数为10％的HAuCl4溶液，搅拌并加热至沸腾；随后加入8mL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液，继续加热搅拌15min；停止加热，搅拌至溶液冷却至室温，即得到酒红色的球形金纳米粒子溶液；步骤五，制备拉曼探针取10mL球形金纳米粒子溶液，离心分离至5mL去离子水中，加入到20mL异丙醇中，加入10μL 10mM DTNB，搅拌反应1h；之后加入100μL氨水和5μL TEOS，室温搅拌反应14h后，离心收集产物，并将产物分散至5mL无水乙醇中，即得到二氧化硅包裹的连接了拉曼分子的金纳米粒子；取500μL二氧化硅包裹的连接了拉曼分子的金纳米粒子，加入5μL 50％的戊二醛，室温振荡1小时后离心分离，水洗2次后将沉淀分离至500μL的去离子水中；加入5μL 1mg/mL的抗体B，室温振荡3小时后离心分离，并用PBS缓冲液清洗一次，将沉淀分散至500μL的PBS中；再加入50μL1％的BSA反应1小时后离心提纯至500μL的PBS中，4℃保存；所述抗体B为rabbit anti‑CD81。