[发明专利]一种O型口蹄疫病毒多肽与SLA-2重链、轻链β2m复性结晶的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种O型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA‑2重链、轻链β2m复性、结晶的方法。本发明以荷包猪为例，构建SLA‑2胞外部区原核表达载体，转入宿主菌获得表达蛋白及其包涵体，通过稀释复性法使SLA‑2、Hu62多肽与sβ2m体外正确结合折叠，再利用分子筛分离纯化复性蛋白质。本发明采用了原核表达系统，高表达了荷包猪的SLA I分子的重链胞外区域和轻链，具有快捷、直观等优点，SLA‑2‑HB‑Hu62‑sβ2m结果获得高质量的单晶，晶体分辨率达到，SLA‑2‑HB‑Hu62‑sβ2m呈现非对称的双分子结构，揭示其可能有两种构象。

主权项

1.一种O型口蹄疫病毒多肽与荷包猪SLA‑2重链、轻链β2m复性、结晶的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)、引物设计与合成依据荷包猪SLA‑2全基因编码序列，分别设计扩增其胞外区的上游引物和下游引物：上游引物pHB21F：5′‑GGAATTCCATATGGGCCCGCATTCCCTGAGCTATTCTTAC‑3′，Nde I限制性酶切位点CA/TATG；下游引物pHB‑21R1：5′‑AGTCTCGAGTTAGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTCCTGC‑3′，Xho I限制性酶切位点CT/CGAG；(2)、多肽的合成以O型口蹄疫病毒设计了Hu62口蹄疫病毒多肽，序列为ALLRTATYY；(3)、SLA‑2‑HB胞外区表达载体的构建用pHB21F/pHB‑21R1作为引物对，以荷包猪SLA‑2‑HB01/pMD18‑T全基因重组质粒为模板，扩增荷包猪SLA‑2胞外区部分，PCR产物5′端带有Nde I限制性酶切位点CA/TATG，3′端带有Xho I限制性酶切位点CT/CGAG，建立如下PCR反应体系，总体积为50μL：包括2.5mmol/L dNTPs 4μL，25pmol/μL上游引物1μL，25pmol/μL下游引物1μL，30ng SLA‑2全基因组质粒1μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL ExTaq酶0.5μL，灭菌水37.5μL；PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃45s，72℃1.5min，共30cycles；72℃10min；4℃保存；PCR产物经切胶回收，并经过Nde I和Xho I双酶切后，与经过同样处理的pET‑21a(+)空载体进行连接，转化BL21感受态细胞，挑取阳性克隆培养，提取质粒进行双酶切鉴定筛选阳性克隆，并测序；(4)、诱导表达、包涵体提取及SDS‑PAGE电泳检测表达蛋白测序正确的SLA‑2重链阳性克隆菌与轻链sβ2m表达菌在有Amp抗性的固体LB平板上划线，平板在37℃培养12小时，挑取单菌落至装有3mL LB+3μL浓度为100mg/mL的Amp培养基的试管中培养10h，把培养好的菌液50μL接入装有50mL LB液体培养基的锥形瓶内，培养基内加入50μL的Amp，锥形瓶37℃恒温振荡过夜培养，用大三角瓶配制2L的LB液体培养基，121℃20min灭菌，将过夜培养的菌往大三角瓶内按1:100的比例接种，并加入2mL浓度为100mg/mL的Amp，在大摇床内37℃恒温震荡培养2个小时测OD值，直至OD为0.5时加入2mL浓度为1mol/L的IPTG进行诱导，37℃培养5h后收菌，将培养的菌转入500mL的离心杯中，4℃下，转速为6000rpm，离心15min后收菌，倒掉上清只留菌体沉淀，收菌后，在低温下，用60ml 1×PBS的悬浮液悬浮菌体，悬浮液含60μl DTT，终浓度为1‰，然后超声裂解，每一次超声6S，间隔12S，重复198次，250W，中间看是否有沉淀，有则搅拌，之后继续超声；4℃下，转速为16000rpm，离心15min后，用玻棒将细菌碎片拨掉，washing buffer共100mL，加入100μL DTT，至终浓度为1‰，洗3次，每次洗后超声4S，间隔10S，重复25次，250W，超声后转速16000rpm，离心15min，washing buffer洗涤，去除细菌碎片；称重，转速16000rpm，离心15min，去上清，沉淀用60mL resuspension buffer，加入60μL DTT，至终浓度为1‰，悬浮，转速16000rpm，离心15min；按30mg/ml用dissolution buffer溶解，dissolution buffer中加入DTT至终浓度为1％，4℃搅拌溶解过夜，转速16000rpm，离心15min，倒出上清或分装成1ml/管，于‑20℃或‑80℃保存备用；(5)、荷包猪重链SLA‑2‑HB、轻链sβ2m及其口蹄疫病毒表位多肽的体外结合荷包猪重链SLA‑2‑HB、轻链β2m与口蹄疫病毒Hu62表位肽在体外结合：1)稀释法复性蛋白质①配制500mL refolding buffer，配方100mmol/L Tris,pH8.0，400mmol/L L‑Arg HCl，2mmol/L EDTA，5mmol/L GSH，0.5mmol/L GSSH，复性液预冷后加入0.5mmol/L PMSF，4℃缓慢搅拌至其完全溶解混匀，②用5mL或10mL注射器将溶解后的包涵体加入注射器内，使之一滴一滴的往refolding buffer内滴下，慢慢搅拌8‑10小时，在4℃条件下，先加轻链β2m，再加多肽，最后加荷包猪重链SLA‑2‑HB，荷包猪重链SLA‑2‑HB分三次加，按摩尔比，荷包猪重链SLA‑2‑HB：轻链β2m：多肽＝1:1:3，③复性后，用浓缩杯浓缩样品换液，缓冲液为分子筛buffer，再转到浓缩管内浓缩，如果复性体系小的话可直接用浓缩管浓缩换液，复性后如果复性液变得浑浊，4℃条件下离心去除沉淀后再浓缩；2)蛋白质浓缩将复性蛋白质体系转入到500mL的离心管内，转速6000rpm，4℃下离心15min，去沉淀，在4℃冷库将上清转入到350mL的搅拌式超滤装置中，浓缩杯底部事先装好10kDa Millipore Centricon蛋白截留膜，利用N2进行加压浓缩，当浓缩至30mL时加入事先预冷抽滤好的分子筛buffer至体积150mL，分子筛buffer为20mmol/L Tris，pH8.0，50mmol/L NaCl，继续浓缩重复上述步骤，最后浓缩至30mL，将溶液转移至30mL离心管中，转速16000rpm，4℃下离心15min，将上清转到超滤浓缩管中进一步浓缩至4mL，将浓缩好的蛋白换到EP管中，转速13300rpm，4℃下离心10min，换管去沉淀；再重复上述步骤一次，检查是否有沉淀，若有继续重复一次，若没有沉淀，冰上放置以备上样用，3)分子筛和SDS‑PAGE鉴定多肽结合分子筛buffer洗涤AKTA的上样泵，之后再用分子筛buffer平衡凝胶柱Superdex 200pg HiLoad 16/600预装柱，将样品4℃下，转速12000rpm，离心10min，去气泡以备上样，以1mL/min的流速运行，按OD280，mAU>20的标准进行收集，定量每管收集1.8mL，收集峰值处的样品进行制备蛋白样品，然后SDS‑PAGE鉴定是否结合，将跑胶显示为复性的蛋白质收集后浓缩，再过阴离子柱Resource Q进一步纯化复性蛋白质，首先用A液、B液交替冲洗Resource Q，除去原先柱子上所挂杂蛋白，后用A液平衡柱子，将复性蛋白质浓缩，离心去沉淀，步骤同分子筛，上样10mL后，用B液清洗结合在阴离子柱上的蛋白，40分钟均匀拉梯度至25％B液，收集OD280在20mAU以上的蛋白质，SDS‑PAGE再次鉴定为复性的蛋白质，收集浓缩后以备点晶体用，其中，A液为10mmol/L Tris pH8.0，10mmol/L NaCl、B液为10mmol/L Tris pH8.0，1mol/L NaCl；(6)、SLA‑2‑HB‑Hu62‑sβ2m复合物蛋白质结晶①将纯化得到的复性蛋白质复合物经分子筛buffer换液，并用10kDa的超滤浓缩管浓缩至100μL，用BSA法测定蛋白质浓度，分别稀释成7.5mg/mL和10mg/mL的浓度，②利用Index1‑48，Index49‑96，PEG/Ion Ⅰ，PEG/Ion Ⅱ,Crystal Screen Ⅰ，Crystal Screen Ⅱ，PEGRx Ⅰ，PEGRx Ⅱ试剂盒，利用座滴法于4℃和18℃分别进行蛋白复合物的晶体筛选，③在48孔的座滴板中，每孔加入120μL池液，在晶体孔中加入1μL蛋白和1μL池液，使其混合，用胶带将48孔板密封，放入晶体生长柜中，一周后，用低倍显微镜观察是否有晶体长出，并做好标记，④如果有晶体生长，将晶体拍照保存，送到X光机上进行衍射鉴定，如果晶体是蛋白晶体且衍射效果好，可以直接收集晶体的数据，如果衍射的效果不佳，则需要重新筛选晶体生长条件或者优化，⑤优化的条件是通过改变初筛条件中的沉淀剂，缓冲pH，离子浓度或者添加剂的方法得到，得到了质量好的蛋白晶体后，重复上述步骤④。