[发明专利]一种DNA片段的拼接方法

摘要

本发明提供了一种核酸片段的拼接方法，通过提供一种设计有同源臂及特定酶切位点的DNA载体；提供多个带有同源臂且相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的待拼接的目标DNA片段；利用无缝克隆将多个待拼接的目标DNA片段一并克隆入所述的DNA载体，从而获得含有更长DNA片段的载体。本发明的方法获得的片段又可以以同样的方式与其他片段进行排接，从而可以源源不断地将更多的片段拼接在一起。在基因工程中，尤其在合成生物学中得到大段的DNA片段非常适用。

主权项

1.一种DNA片段的拼接方法，包括下列步骤：1)提供一种DNA载体，所述载体上至少顺序包含四个不同的酶切位点，即酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D，其中，酶切位点A和酶切位点B之间设有载体左同源臂，酶切位点C和酶切位点D之间设有载体右同源臂；2)提供多个待拼接的目标DNA片段，相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠，且首个待拼接目标DNA片段的首部设有与步骤1)所述DNA载体的载体左同源臂同源的左臂序列，末个待拼接片段的尾部设有与步骤1)所述DNA载体的载体右同源臂同源的右臂序列；3)将步骤2)所述的多个待拼接的目标DNA片段经无缝克隆的方法一并克隆入步骤1)所述的DNA载体，获得的载体中，所述多个待拼接的目标DNA片段按照设计的拼接顺序相连；所述酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D顺次分别为限制性内切酶Sbf I、Bpi I、Esp3I和AsiS I的酶切位点；其中，步骤1)所用的DNA载体的序列为SEQ ID NO:15；步骤1)所述的DNA载体被限制性内切酶B和限制性内切酶C酶切线性化；步骤2)中，至少一个待拼接的目标DNA片段采用包括下列步骤的方法获得：a)提供两端附加有与步骤1)提供的DNA载体中所述载体左同源臂同源的左臂序列及与所述载体右同源臂同源的右臂序列的待拼接的目标DNA片段；b)将步骤a)的片段经无缝克隆的方法克隆入步骤1)提供的DNA载体中，获得克隆有待拼接的目标DNA片段的载体；c)将步骤b)获得的载体扩增后，经内切酶A和内切酶C酶切，或内切酶B和内切酶D酶切，或内切酶B和内切酶C酶切获得所述待拼接的目标DNA片段；步骤c)中，当所述载体克隆有首个待拼接目标DNA片段时，采用内切酶A和内切酶C酶切；当所述载体克隆有末个待拼接目标DNA片段时，采用内切酶B和内切酶D酶切；若待拼接目标DNA片段数目超过两个，当所述载体克隆有中间待拼接目标DNA片段时，采用内切酶B和内切酶C酶切；所述方法还包括：4)将步骤3)获得的DNA载体酶切分离拼接完成的DNA片段；将步骤4)获得的拼接完成的DNA片段作为待拼接的目标DNA片段，进一步拼接更长的DNA片段。