[发明专利]一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的方法

摘要

本发明涉及一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇(PEG-dithiol)残留的检测方法，依据Ellman’s试剂与巯基反应生成的化合物与PEG-dithiol的含量在412nm处呈线性关系的原理建立了一种操作简单、快速的交联凝胶中PEG-dithiol残留的检测方法。该检测方法在40-200μg/ml范围内具有良好的线性关系,尤其可用于大分子交联凝胶的检测。

主权项

一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)磷酸盐缓冲液的制备：取无水磷酸氢二钠912mg，一水合磷酸二氢钠300mg,加水使溶解成500ml，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；(2)PEG‑dithiol对照品溶液的制备：精密称取二巯基聚乙二醇对照品40mg，置20ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成浓度为0.4mg/ml的PEG‑dithiol对照品溶液；(3)醋酸盐缓冲液的制备：取11.55ml冰醋酸，定容至1000ml，得到浓度为0.2mol/L醋酸；称取16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1000ml水中，得到浓度为0.2mol/L醋酸钠；取148ml浓度为0.2mol/L醋酸溶液与352ml浓度为0.2mol/L醋酸钠溶液混匀，得到pH为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液；(4)酶溶液的制备：称取simga公司出品的809U/mg透明质酸酶30mg，加pH值为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液溶解制成10ml酶溶液；(5)样品溶液制备：取交联透明质酸钠凝胶1.0g，加1.0ml步骤(4)制备的酶溶液，置37℃降解2.0h，使凝胶降解成样品溶液备用；(6)反应缓冲液制备：称取35.814g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液；称取15.601g二水合磷酸二氢钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液；吸取9.32ml的浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液加水稀释至90ml，混匀，用氢氧化钠试液调pH值至8.0，加水定至100ml，得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液；称取0.03724g EDTA至pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液中，混匀，得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L反应缓冲液；(7)DTNB溶液的制备：称取40mg DTNB，加步骤(6)制备的反应缓冲液溶解制成DTNB溶液备用；(8)标准曲线的制备：精密量取步骤(2)制备的PEG‑dithiol对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml置1.5ml离心管中，依次加入pH值为7.4磷酸盐缓冲液至1.0ml，混匀；分取上述溶液各0.5ml，加0.5ml步骤(4)制备的酶溶液，混匀，37℃放置约2.0h，再分别步骤(6)制备的反应缓冲液5.0ml，涡旋混匀，加入步骤(7)制备的DTNB溶液0.2ml，混匀，室温放置15分钟；以对照品溶液0ml经上述方法制备的溶液为空白，在412nm的波长处测定吸光度，以对照品溶液的浓度对相应的吸光度计算回归方程；(9)交联透明质酸钠凝胶PEG‑dithiol残留的测定：取步骤(5)制备所得的样品溶液1.0ml，按步骤(8)加入步骤(6)制备的反应缓冲液和步骤(7)制备的DTNB溶液反应15分钟，在412nm的波长处测定吸光度，根据回归方程计算交联透明质酸钠凝胶中PEG‑dithiol的残留。