[发明专利]一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法

摘要

本发明公开了一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：1)引物设计：采用柑桔黄龙病菌的16SrDNA作为靶基因，设计4条LAMP特异性引物；2)核酸提取：按照CTAB法提取柑桔叶片总DNA；3)LAMP特异性检测：取5×Reaction Buffer、F3和B3引物、FIP和BIP引物、Mg2+、dNTPs、Bst DNA聚合酶、模板、加ddH2O定容至25μL；将反应PCR管置于恒温孵育器反应，之后灭活结束反应；本发明操作简便、对环境设施设备要求不高、成本低，快速准确，特别适合对于亚洲柑桔黄龙病的大规模初筛，为柑桔黄龙病的检测与防控提供了一种新的手段。

主权项

1.一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)引物设计：采用柑桔黄龙病菌的16SrDNA作为靶基因，应用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区，利用在线设计软件Primer Explorer V 4.0，设计LAMP引物，包括2条外引物F3/B3，2条内引物FIP/BIP，针对6个特定区域设计4条特异性引物，引物序列如下：①引物名称：F3；引物序列(5’‑3’)：CGCCGGAGAAGATAATGAC；②引物名称：B3；引物序列(5’‑3’)：GTGTTCCTCCGAATATCTACG；③引物名称：FIP；引物序列(5’‑3’)：GTTATTCCGAACAACGCTCGCGGTATTCGGAGAAGAAGCC；④引物名称：BIP；引物序列(5’‑3’)：GGCGGGCGATTAAGTTAGAGGTCCTAAACTCTAGACAACCAGT；2)核酸提取：2.1)按照CTAB法提取柑桔叶片总DNA；2.2)提取的DNA冷冻保存备用；3)LAMP特异性检测：3.1)取5×Reaction Buffer 5μL，5μmol/L F3和B3引物各1μL，40μmol/L FIP和BIP引物各1μL，Mg2+0.8μL，dNTPs1.2μL，Bst DNA聚合酶1μL，模板2μL，加ddH2O补足至25μL；3.2)将反应PCR管置于恒温孵育器，65℃反应80min，之后80℃下灭活5min结束反应。