[发明专利]单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC‑HSV‑1载体和pREDI重组质粒的宿主菌；S2 BAC载体的切除及HSV‑1 UL5基因缺失的DNA疫苗的获得。本发明属于生物医药技术领域，通过本发明提供的方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等优点，可有效防治HSV‑1的感染。

主权项

1.一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1 单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC‑HSV‑1载体和pREDI 重组质粒的宿主菌；S2 BAC载体的切除及HSV‑1 UL5 基因缺失的DNA疫苗的获得；所述步骤S1包括如下步骤：S1.1 pREDI 重组质粒的构建：设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片段；设计I‑SceI的PCR扩增引物，PCR扩增得到I‑SecI片段；将所述PrhaB片段和所述I‑SecI片段通过重组PCR连接，得到PrhaB‑I‑SecI片段；将所述PrhaB‑I‑SecI片段和pKD46 λ‑red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒；S1.2 重组敲除系统的构建：将所述pREDI重组质粒转入含BAC‑HSV‑1载体的宿主菌中，得到同源重组敲除的重组敲除系统；S1.3 UL5 基因同源重组片段的 PCR 扩增：以所述重组敲除系统的Kam‑SacB全片段为模板，以CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA 为上游引物，以GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC为下游引物，通过PCR扩增获得UL5C‑Kam‑SacB‑B片段，再以该片段为模板，以GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC为上游引物，以GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC 为下游引物，通过PCR扩增获得UL5A‑C‑Kam‑SacB‑B片段，即UL5 基因同源重组片段；S1.4 携带正反选择标记基因的重组菌株的筛选：将所述UL5 基因同源重组片段电转化至所述重组敲除系统中，通过正向筛选标记基因 Kam进行重组细菌的筛选；对转化获得的单克隆进行PCR 鉴定，确定筛选的重组菌株UL5基因的成功去除及正反标记基因的正确插入；S1.5 去除正反选择标记基因的重组菌株的鉴定：鼠李糖诱导I‑SceI内切酶合成，切除Kam‑SacB片段，发生第二次同源重组，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株；所述步骤S2包括如下步骤：S2.1 将所述不含UL5基因和外源基因的重组菌株进行扩大培养，进行质粒抽提，获得BAC‑17.37ΔUL5质粒，电转化至Vero‑pCDNA3.1‑UL5‑Cre细胞，使用含G418的培养基进行培养，通过蓝白斑实验挑选白斑，反复冻融，离心取上清得到HSV‑1 UL5 基因缺失的DNA疫苗；S2.2 将S2.1得到的HSV‑1 UL5 基因缺失的DNA疫苗感染Vero‑pCDNA3.1‑UL5细胞，再通过蓝白斑实验挑取白斑，反复冻融，离心取上清，得到纯化后的HSV‑1 UL5 基因缺失的DNA疫苗。