[发明专利]赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法

摘要

本发明公开了一种赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明以以赤魟软骨为原料，通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Ile‑Glu‑Pro‑His，ESI‑MS测定分子量为494.55 Da；制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，且有良好的脂质过氧化抑制作用，具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等。

主权项

赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）赤魟软骨总蛋白粗提物的制备：称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的赤魟软骨浸于4～6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中，该盐酸胍溶液中含0.02 mol/L MES、 0.02 mol/L EDTA及pH值为7～8，于4 ℃下搅拌抽提36～48 h；提取液在4 ℃下以4000～6000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质；将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用pH 值为7.6的Tris‑HCl缓冲液于4 ℃下透析24～48 h，透析袋内溶液即为赤魟软骨总蛋白粗提物；2）赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取赤魟软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在‑20 ℃下静置4～6 h后，于4 ℃、10000～12000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得赤魟软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白；3）赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取赤魟软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5 mL溶于Tris‑HCl缓冲液，该缓冲液为0.05mol/L、pH 值为7.5～8.5，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入1.9×10⁴ U/g的胰蛋白酶，于40 ℃酶解3～5 h，然后于90 ℃、10 min灭酶活，酶解液于4 ℃、10000～12000 r/min离心15～25 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液；4）赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化肽。