[发明专利]一种川贝母的组织培养方法

摘要

本发明公开了一种川贝母的组织培养方法，川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）系百合科贝母属多年生草本药用植物，以地下鳞茎入药，具有清热润肺，化痰止咳的功效，为《中国药典》（2005年）规定的著名中药材川贝的主要来源之一。川贝母分布于高海拔地区，靠种子繁殖，繁殖率低，且生长周期长，由于长期采挖，野生资源匮乏，急需解决其市场需求量大的问题。本发明以川贝母鳞茎为外植体，通过外植体消毒，两种不同状态愈伤组织的诱导，鳞茎分化、增殖、生根培养、炼苗移栽等过程获得了川贝母离体再生植株，建立有效的组培快繁体系，可短时间内生产大量种苗，提高繁殖效率，有利于加快川贝母的繁殖推广。

主权项

一种川贝母的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)外植体的选择与处理：选取健康新鲜的川贝母鳞茎为外植体，在自来水下冲洗，用软毛刷洗净泥土，并去除鳞茎基部的须根，再蘸取由1g洗洁精溶于100ml蒸馏水的洗洁精稀释溶液清洗外植体表面，并用自来水冲洗25‑30分钟，冲洗干净，备用；(2)外植体消毒：将洗净的鳞茎外植体放入小烧杯中，转至超净工作台上，倒入浓度75％乙醇溶液浸泡并摇晃8‑10s，取出用无菌水冲洗2次，并将鳞茎外植体放置到经过高温灭菌的无菌瓶中，加入由1g Hgcl2溶于1000ml蒸馏水制成的浓度0.1％升汞溶液浸泡并在震荡下灭菌8‑10min，倒掉升汞，用无菌水洗6次，每次2min，最后留部分无菌水浸泡外植体，备用；(3)愈伤组织诱导：经上一步骤消毒的外植体用无菌吸水纸吸干表面水分，在无菌条件下切割成0.5‑0.8cm的小方块，接种于初代愈伤组织诱导培养基中诱导贝母愈伤组织；培养室的培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天，经过15天开始形成愈伤组织，该愈伤组织为致密的块状；(4)块状愈伤组织的增殖和分化：经过步骤(3)诱导后得到排列紧密、呈浅绿色或淡黄色的块状愈伤组织，将该块状愈伤组织切成0.5‑0.7cm的小方块，接种于继代培养基中，实现块状愈伤组织的增殖，并同时出现川贝母小鳞茎的分化，该继代过程30天一次，经一次或多次继代，得到更多的小鳞茎；培养条件：培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照强度2000Lx，光照时间12小时/天；(5)疏松颗粒状愈伤组织的诱导及增殖：经步骤(4)继代后得到的块状致密愈伤组织，接种于初代愈伤组织诱导培养基诱导产生疏松的颗粒状愈伤组织，该疏松的颗粒状愈伤组织接种到增殖培养基中实现短时间大量繁殖；培养条件：培养温度21±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照强度500‑1200Lx，光照时间12小时/天，增殖过程中，继代时间为24‑26天；(6)胚状体的分化和生长：经步骤(5)增殖所得的疏松颗粒状愈伤组织多为胚性愈伤组织，在MS培养基中培养得到川贝母小鳞茎胚状体，该胚状体在MS培养基中继续培养长成健康的川贝母小鳞茎；培养条件：光照强度1500‑2000LX，光照时间10‑15小时/天，培养温度19‑22℃，空气相对湿度70％‑80％；(7)生根培养：将步骤(4)和步骤(6)中得到的川贝母小鳞茎切下，接种于生根培养基中诱导生根；培养条件：培养温度为23±1℃，空气相对湿度70％‑80％，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx，待川贝母小鳞茎长至5cm高，且长出6‑10条根系时，即可进行下一个步骤；(8)炼苗移栽：将步骤(7)得到的生根无菌苗在出瓶前转至温室苗床上，保持环境温度20‑25℃，湿度80％‑85％，光照强度5000Lx，培养1周，逐渐打开瓶口，培养3‑4天，增强对外界环境的适应能力；再将无菌苗从瓶中取出洗净基部的培养基，然后移栽到按重量比例由腐殖土：珍珠岩：蛭石＝4:2:1组成的基质中，定期浇施MS营养液，覆盖薄膜，一周后揭膜，揭膜20天统计成活率。