[发明专利]一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法

摘要

本发明公开了一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法。包括(1)红豆杉愈伤组织的悬浮培养挑取培养15d的白色或者淡黄色的愈伤组织，使用改良的MS‑I号培养基；(2)红豆杉细胞系悬浮预培养使用改良的MS‑II号培养基预培养1天；(3)包埋；(4)预处理用预装载液LB7处理胶球30～60分钟；(5)装载用PVS3对胶球处理30～60分钟；(6)冷冻保存；(7)解冻用45℃恒温水浴1分钟左右化冻；(8)恢复培养，在6周左右可以恢复生长。本发明方法操作简单易行，且恢复生长时间短，适合大规模的红豆杉种质资源的保存，方法适合多种红豆杉细胞系的保存，具有广谱的适应性。

主权项

一种红豆杉悬浮细胞包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)红豆杉愈伤组织的悬浮培养：挑取红豆杉愈伤组织接种于改良的MS‑I液体培养基中进行悬浮培养，改良的MS‑I液体培养基为：2500mg/L KNO3，2500mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2‑EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，1～3mg/Lpicloram，0.5～1mg/L 6‑BA，用蒸馏水定容到1L，pH值为5.8；(2)红豆杉细胞系悬浮预培养：取步骤(1)中得到的分散良好的红豆杉悬浮细胞接种于改良的MS‑II液体培养基中悬浮培养1d；改良MS‑II液体培养基为：1000mg/L KNO3，500mg/L KCl，800mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2‑EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，60g/L D‑山梨醇，1～3mg/Lpicloram，0.5～1mg/L 6‑BA，用蒸馏水定容到1L，pH值为5.8；(3)包埋：将步骤(2)中的红豆杉细胞与海藻酸钠包埋液混合，滴入Ca2+溶液中形成包含红豆杉细胞的胶球；(4)预处理：将步骤(3)得到的包含红豆杉细胞的固定化胶球在预装载液中预处理，时间为30‑60分钟；(5)装载：取步骤(4)预处理后的胶球使用装载液进行玻璃化处理，时间为30‑60分钟；(6)冷冻保存：取步骤(5)中玻璃化处理后的胶球，更换4℃储藏的相同玻璃化液后连同冻存管一并立即放入液氮中保存；步骤(4)的预装载液为LB7，配方为：300g/L甘油，150g/L二甲基亚砜，400g/L蔗糖，150g/L海藻糖，2500mg/L KNO3，2500mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，37.3mg/L Na2‑EDTA，27.8mg/L FeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，1～3mg/Lpicloram，0.5～1mg/L 6‑BA，用蒸馏水定容到1L。