[发明专利]水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法

摘要

水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法，涉及毛皮动物病毒性传染病病原的检测技术领域。本发明的胶体金检测试纸条包括：样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜的检测线上喷涂VP2蛋白，所述NC膜的质控线上喷涂羊抗鼠二抗。本发明的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：原核表达水貂细小病毒(MEV)VP2及VP1蛋白及其纯化；水貂细小病毒(MEV)单克隆抗体的制备；胶体金溶液的制备；金标抗体溶液的制备；金标垫的制备；NC膜的预处理；组装。本发明有助于毛皮动物养殖场净化水貂细小病毒性肠炎，方便基层兽医人员的操作。

主权项

水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、PCR扩增水貂细小病毒MEVB株VP2基因及VP1部分基因，定向克隆至原核表达载体构建重组质粒，并转化至宿主菌BL21中，IPTG诱导后经纯化后得到水貂细小病毒VP2蛋白和水貂细小病毒VP1蛋白；所述原核表达载体为PET‑30a；水貂细小病毒VP2蛋白和水貂细小病毒VP1蛋白的纯化方法为：利用His标签进行纯化，经His Bind Purification Kit纯化试剂盒纯化即可得到目的蛋白；步骤二、利用纯化的水貂细小病毒VP1蛋白制备水貂细小病毒单克隆抗体，具体方法为：(1)将纯化的水貂细小病毒VP1蛋白免疫BABL/c小鼠，首次免疫将水貂细小病毒VP1蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化后，采用腹腔注射方式免疫，每间隔两周进行一次免疫，共免疫4次，其中第2次、第3次采用弗氏不完全佐剂乳化，第4次是融合前3天的加强免疫；(2)加强免疫后经过间接ELISA方法测定小鼠血清抗体效价，水貂细小病毒抗体效价达到10⁵以上进行融合，无菌取小鼠脾脏，研磨离心后与骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用间接ELISA方法进行筛选以及有限稀释法进行亚克隆，最终筛选出分泌抗水貂细小病毒抗体的杂交瘤细胞株14株，选取亲和力强的细胞株采用体内制备抗体的方法，制备水貂细小病毒单克隆抗体；步骤三、采用柠檬酸还原法制备20nm胶体金溶液，具体方法为：取1％的氯金酸溶液1mL加入去离子水99mL充分混匀后，加热至沸腾；边搅拌中边加入1％的柠檬酸三钠溶液1.5mL，混匀，并使其保持沸腾状态，溶液颜色则由浅黄色依次转变为浅黑色、黑色、深紫色，最终稳定为酒红色，继续煮沸5min，待冷却后用去离子水补充至100mL，获得20nm胶体金溶液，4℃避光保存，步骤四、采用20nm胶体金溶液标记水貂细小病毒单克隆抗体获得金标抗体溶液，具体方法为：(1)取20nm的胶体金溶液1mL，用0.1mol/L的K₂CO₃溶液调至最佳PH值8.0，搅拌混匀；(2)加入纯化后的水貂细小病毒(MEV)单克隆抗体12μg，混匀，室温静置30min；(3)加入PEG‑20000和BSA溶液搅拌混匀，静置30min；(4)将已经标记好的胶体金探针1500r/min离心30min，去除沉淀；上清12000r/min离心30min，弃上清；将沉淀的胶体金探针用BSA和叠氮钠溶液悬浮并离心，最后将沉淀用1mL的BSA和叠氮钠溶液的混合物进行溶解，获得金标抗体溶液，4℃避光保存；步骤五、玻纤膜经预处理后，按照6μl/cm的点样量在玻纤膜上喷涂金标抗体溶液，获得金标垫；玻纤膜的预处理过程为：将玻璃纤维素膜切割成5mm×30cm的长条，用0.01mol/L、PH为8.2的TB溶液处理，置于37℃烘干；步骤六、将纯化后的浓度为0.85mg/ml的水貂细小病毒VP2蛋白喷涂在NC膜的检测线上，将浓度为1mg/ml的羊抗鼠二抗喷涂在NC膜的质控线上；步骤六中，采用BiodotXYZ3060仪器将纯化后的VP2蛋白及羊抗鼠二抗划线于NC膜上；划线参数为：T线2μl/cm，C线1μl/cm，T线与C线间隔5mm；Biodot XYZ3060仪器参数为：T线速度50mm/s，加速度1000mm/s²，Z轴下降55mm，drop为40nl，pitch 0.4，on time 0.4；C线速度50mm/s，加速度1000mm/s²，Z轴下降55mm，drop为40nl，pitch 0.4，on time 0.4；步骤七、将NC膜、金标垫、样品垫和吸收垫组装成胶体金检测试纸条。