[发明专利]通过与氨甲蝶呤选择偶联的睡美人转座子制备工程化T细胞

摘要

本文描述的发明的方面包括使用具有针对通过病毒或癌症细胞呈现的分子的受体的基因工程化人T细胞，治疗、抑制、改善和/或清除受试者的病毒或癌细胞的方法，其中基因工程化T细胞是使用采用增加浓度的MTX的二级MTX选择分离的。

主权项

1.一种产生用于过继T细胞免疫治疗的工程化多重T细胞的方法，包括：/n提供基因递送多核苷酸，所述基因递送多核苷酸包括用于插入基因组的核酸，其中用于插入的所述核酸的侧翼为反向末端重复基因序列，并且其中所述基因递送多核苷酸是可选择的，并且包括：/n第一序列，所述第一序列包括第一反向末端重复，/n第二序列，所述第二序列包括第二反向末端重复，/n第三序列，所述第三序列包括启动子，/n第四序列，所述第四序列包括编码蛋白质的至少一个基因或用于mRNA转录的序列，其中所述第四序列是密码子优化的，/n第五序列，所述第五序列包括编码二氢叶酸还原酶(DHFR)双突变体的至少一个选择标记盒，所述二氢叶酸还原酶双突变体对氨甲蝶呤的亲和性降低至约1/15,000，其中，所述氨甲蝶呤能够用于选择用所述基因递送多核苷酸转导的细胞以提高表达所述至少一个基因的细胞的比，并且其中，所述第五序列是密码子优化的，/n第六序列，所述第六序列包括第一附着位点(attP)，以及/n第七序列，所述第七序列包括第二附着位点(attB)，/n其中，所述第一序列、所述第二序列、所述第三序列、所述第四序列、所述第五序列、所述第六序列和所述第七序列中的每一个均具有5’端和3’端，并且其中，所述第一序列的3’端邻接于所述第三序列的5’端，所述第三序列的3’端邻接于所述第四序列的5’端，所述第四序列的3’端邻接于所述第五序列的5’端，以及所述第五序列的3’端邻接于所述第二序列的5’端；/n将所述基因递送多核苷酸引入T细胞；/n提供编码睡美人转座酶的载体；/n将所述编码睡美人转座酶的载体引入所述T细胞；/n选择包括所述基因递送多核苷酸的细胞，其中选择包括第一轮选择和第二轮选择，其中，所述第一轮选择包括添加第一浓度范围的选择试剂，以及所述第二轮选择包括添加第二浓度范围的选择试剂，其中，所述第二浓度范围是所述第一浓度范围的至少1.5倍；以及/n在选择压力下分离表达表型的T细胞。/n