[发明专利]一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法

摘要

本发明公开了一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，建立了羊踯躅组织培养过程中最佳快速繁殖体系和保存体系，包括最适宜的外植体的选择方法，高效的多重灭菌方法，羊踯躅离体生长繁殖与保存的最适宜培养基组份以及不定芽生根、驯化移栽条件的控制等关键技术问题，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖。本发明可使羊踯躅试管苗的分化率达到达100％，不定芽增殖系数月增殖倍数达8‑10.5，40d后生根率和驯化成活率均在85％以上。这可以有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求，进而减少人们对野生羊踯躅的破坏，有利于濒危野生羊踯躅的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。

主权项

一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，其特征在于，(1)外植体的活体增殖与选择：为了能收集更多分生能力好的腋芽，将野外活体羊踯躅的顶芽剪去，10‑20天后每一枝条可新萌发3‑5个新的嫩腋芽，等腋芽长至1‑2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；(2)多重表面灭菌流程：外植体用软毛笔刷洗枝叶，用自来水洗去枝叶上的灰尘后，在超净台上放入无菌瓶中，用70％体积比的乙醇表面灭菌0.5‑1分钟，接着多重灭菌法灭菌，即先用10％的双氧水H₂O₂表面灭菌10min，所述双氧水含0.5％的吐温20，无菌水冲洗2‑3次，接着再用0.1％的升汞HgC1₂，所述升汞含0.5％的吐温20，灭菌5‑8min，最后用无菌水冲洗3‑5次，灭菌后的腋芽外植体备用；(3)接种初代培养：去除外植体接种在腋芽启动分化的培养基上，培养基组成为改良的6,7‑V+ZT玉米素1.0mg/L，培养基的蔗糖用量30g/L，琼脂为0.8％，pH值为5.6，培养参数为25士2℃，相对湿度为60‑70％，光照强度为2000‑2500Lx，光照时间14h/d，技术指标为外植体污染率低于10％‑20％；(4)分化培养：将步骤3中的腋芽长至4‑6cm时，去除老叶，取新长出的外植体顶芽和茎段约1‑2cm转接到分化扩繁培养基上6,7‑V+ZT 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+2,4‑D 0.05mg/L进行脱分化和增殖培养20‑40d，脱分化率达100％；培养条件同步骤3；(5)离体快速繁殖培养：将步骤4中经脱分化的不定芽转至繁殖培养基上，培养成份和培养条件同步骤3,每瓶40‑50ml左右培养基中接种3‑4个1‑2cm的不定芽，从组培苗茎基部分化产生出丛生苗，技术参数为不定芽增殖系数达8‑10.5；(6)羊踯躅不定芽的离体保存培养：离体培养的不定芽可以在离体条件下延缓生长，采用的培养基为1/2的6,7‑V+玉米素ZT 1.0mg/L，培养基的蔗糖用量15/L，培养温度15‑20℃，其他培养的环境条件同步骤(3)。技术参数为不定芽3‑4个月转接一次；(7)生根培养及驯化移栽：切取步骤5中取健壮、整齐一致的芽用于生根，生根培养基为1/26,7‑V基本培养基添加0.05mg/L NAA上的培养基上生根，培养条件同步骤3，30‑40d后揭去已生根苗的瓶盖使组培苗适应自然环境2‑5d，随后移栽入营养钵中，基质为珍珠岩，营养土＝1：2，进行驯化移栽，营养钵用小拱棚保湿，相对湿度位70‑80％，温度为20‑25℃，10‑15d后逐渐揭开棚膜，15d后完全揭开小拱棚膜，技术参数为生根率和驯化成活率均达85％以上。