[发明专利]一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，通过提出了一种基于HSV-1作为生长因子载体，构建HSV-生长因子重组体的方法，并且公开了构建方法的具体步骤和相关参数；经过合理本发明HSV减毒灭活载体可携带高表达4-5倍的生长因子，HSV携带生长因子重组体转染神经元效率高达95％，具有良好的感染性；HSV-神经生长因子治疗外伤性脑损伤有明显疗效，可改进神经功能。

主权项

一种中枢神经组织细胞高效表达生长因子重组体的构建方法，其特征在于，所述的构建方法以HSV‑1作为生长因子载体，构建HSV‑生长因子重组体，包括了以下步骤：非复制性HSV‑1载体骨架构建：将野生的HSV‑1 CL‑1株利用同源重组方法删除ICP27、ICP4、ICP34.5基因，构建出非复制，低毒性的HSV‑1载体，并命名为NX01载体；补偿细胞系筛选及培养：将HSV‑1 ICP27基因构建到含有新霉素筛选标记的质粒，转染Vero细胞系，使用新霉素筛选，获得稳定表达ICP27蛋白的Vero细胞系，并命名为Vero HSV‑1 CL‑1‑ICP 27细胞系；将HSV‑1 ICP4基因构建到含有Zeozin筛选标记的质粒，转染Vero HSV‑1 CL‑1‑ICP 27细胞系，使用Zeozin筛选，获得稳定表达ICP4蛋白的Vero细胞系，并命名为OG01细胞系；pNX‑CMV中间质粒构建：分别用PCR扩增位于LAT区的两段相邻的同源序列，根据同源序列设计引物，携带SalI和XbaI酶切位点，通过SalI和XbaI酶切LAT的同源序列将之构建到pSP72质粒上，并命名为pNX质粒；然后CMV启动子根据设计的引物携带SphI和PstI酶切位点，通过SphI和PstI酶切目的基因将CMV构建到pNX质粒上；WPRE元件根据设计的引物携带EcoRI和ClaI，通过EcoRI和ClaI酶切将WPRE元件构建到pNX质粒上；PolyA元件根据设计的引物携带EcoRV和BglII酶切位点，通过EcoRV和BglII酶切将PolyA元件构建到pNX质粒上，并命名为pNX‑CMV中间质粒；pNX‑CMV‑生长因子质粒构建：根据生长因子基因设计引物，携带HindIII和XhoI酶切位点，PCR扩增生长因子基因片段，HindIII和XhoI酶切生长因子基因片段，与同样酶切处理的pNX‑CMV中间质粒连接，转化，鉴定出正确的质粒；非复制性HSV‑1载体构建：pNX‑CMV‑生长因子质粒DNA和非复制性HSV‑1载体骨架DNA使用磷酸钙共沉淀法共转染OG01细胞系，挑取阳性病毒斑；将PCR验证目的基因重组正确的病毒斑扩大培养，使用凝胶柱纯化，超滤管超滤，获得高滴度，非复制性的HSV‑1载体。