[发明专利]含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法

摘要

本发明提供一种含大环多胺[12]aneN₃的阳离子脂质以及含有该阳离子脂质的转基因载体。本发明还公开了所述阳离子脂质和转基因载体的制备方法。本发明提供的阳离子脂质含有脂肪酸链，可以有效降低DNA的凝聚浓度，并利用其疏水性功能与DNA形成纳米颗粒通过内吞作用进入细胞中，利于跨膜，采用阳离子脂质形成的转基因载体具有低的细胞毒性，具有较高的转染效率；阳离子脂质和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控。

主权项

1.一种含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质的转基因载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：1)含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质的制备：所述阳离子脂质的结构式(I)如下：式(I)中，R为R＝(CH2)8CH3，(CH2)10CH3，(CH2)12CH3，(CH2)14CH3，(CH2)16CH3，(Z‑)(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3中的一种；步骤一、向溶解有式1化合物的乙腈溶液中加入1,3‑二溴丙烷，搅拌回流反应8～10小时，减压浓缩除去溶剂得到黄色固液混合物，向其中加入乙醇和氢溴酸，搅拌回流反应7～8小时，反应结束后，静置，用水萃取有机层，合并水层，减压浓缩得到浅黄色或者白色固体，将固体真空干燥得到式2化合物，将式2化合物溶解于四氢呋喃中，于冰水浴中加入三乙胺和叔丁氧羰基酸，室温反应8～10小时，反应产物经柱层析分离得到式3化合物；步骤二、所述步骤一得到的式3化合物与叠氮化钠于N,N‑二甲基甲酰胺中加热反应8～10小时，反应结束后，向体系内加入饱和食盐水，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥有机相后浓缩溶剂得到式4化合物，其中，式3化合物与叠氮化钠的摩尔比为1∶1.5，加热反应的温度为68℃；步骤三、将所述步骤二得到的式4化合物溶于无水的四氢呋喃与甲醇混合液，其中，无水的四氢呋喃与甲醇的体积比为1:1，搅拌下向体系中加入催化剂，在氢气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压抽滤，滤液减压浓缩得到式5化合物，其中，所述催化剂为钯碳催化剂，式4化合物与钯碳催化剂的质量比为10∶1；步骤四、将长链脂肪酸溶解于三氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺，于冰水浴下搅拌，待产生白色沉淀时，加入式5化合物与4‑二甲氨基吡啶，将混合物在冰浴下搅拌24小时后，减压抽滤，得到滤液减压旋干后加入乙酸乙酯，在冰浴下再次搅拌0.5小时后，再次减压抽滤，得到滤液旋干后进行柱层析得到式6化合物，所述柱层析采用的洗脱剂为乙酸乙酯与甲醇，其中，长链脂肪酸为0.30mmol、二环己基碳二亚胺为0.36mmol、化合物5为0.3mmol与4‑二甲氨基吡啶为7.4mg，乙酸乙酯与甲醇的体积比为30∶1；步骤五、将步骤四得到的式6化合物溶于无水二氯甲烷中，于冰浴下，向其中滴加入溶有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，室温下搅拌6小时，反应结束后，将溶剂与过量的三氟乙酸减压旋干，用二氯甲烷‑正己烷重结晶得到式7化合物阳离子脂质；2)含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质的转基因载体的制备：将步骤五得到的含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺与无水氯仿加入到高温灭菌的烧瓶中，溶解后减压浓缩得到转基因载体膜，将所述转基因载体膜真空干燥去除残留氯仿，干燥后的转基因载体膜与预先预热到70℃的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液混合配成所需浓度的溶液，超声得到所述转基因载体，其中，三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液的摩尔浓度为10mM，pH为7.4。