[发明专利]一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法

摘要

本发明公开了一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法，利用刚出生未哺乳仔猪口腔黏膜上皮组织进行原代培养、连续传代培养，最终获得一株纯度高、稳定性好的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系。本发明获得的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系生长迅速、性能稳定，第110代的细胞仍保持着原代细胞的形态特征，核型分析表明细胞没有发生突变。本发明构建的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系为连续传代后自发形成，不存在外源基因的插入和基因突变，作为疫苗研发中的基质细胞，没有生物安全风险。本发明的细胞系可以为分子生物学和病毒学研究提供一个良好的细胞模型，也可用于猪源病毒疫苗的研发。

主权项

一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括：首先将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死。酒精消毒，剪取面颊部位对应的口腔上皮组织，无菌条件下PBS漂洗数遍，PBS含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B；除去肉眼可见的非上皮组织，将口腔上皮组织剪成组织块，移入离心管中，加入2.5mg/mL Dispase II溶液；将表皮组织剪成小块，PBS漂洗，离心，接种于培养板，加入原代培养用生长液，置于37℃、5％CO₂条件下培养，每日观察细胞形态及生长情况；原代细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗一遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，加入含10％血清的培养基终止消化，消化后的细胞按1∶2或1∶3的比例进行传代，置于37℃、5％CO₂条件下培养，当细胞再次生长至80％～90％融合时，继续传代培养，当传代细胞能够传代超过50代时，获得自发永生化的细胞系。