[发明专利]一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，利用重编程因子将小鼠成纤维细胞直接重编程为高效分化的心肌细胞为切入点，研究低氧对直接重编程产生心肌细胞的效率及成纤维细胞重编程为心肌细胞过程中HIF-1表达水平的变化，系统阐述低氧对细胞直接重编程的作用。同时检测了多潜能转录因子和表观遗传调控因子这在低氧刺激下的表达情况。用体细胞直接重编程得到的个体化心肌细胞用于心肌梗死的修复，将为提高临床细胞移植的效率和安全性打下基础。探讨低氧微环境与重编程的关系，为低氧下重编程机制的研究提供新的思路。

主权项

一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建慢病毒载体，利用293T细胞包装生产病毒，将携带转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的慢病毒感染小鼠背部皮肤成纤维细胞，将成纤维细胞直接重编程为心肌细胞；重编程过程中转染的细胞分别进行对照组常氧培养和低氧2％O₂+5％CO₂+93％N₂预处理6h、12h，在培养过程中每天观察重编程细胞的形态改变；在转导后第1、2、3、4周，利用RT‑PCR、免疫细胞化学和流式细胞技术检测低氧不同时间心肌特异标记Myh6阳性的细胞比率；收集低氧组重编程细胞，利用RT‑PCR检测HIF‑1在重编程细胞中的表达，在mRNA水平上对其进行分析；体外低氧条件2％O₂+5％CO₂+93％N₂下，培养小鼠背部皮肤成纤维细胞，实验组分低氧6h、12h、24h、48h组，常氧为对照组；用免疫细胞化学方法和RT‑PCR检测小鼠皮肤成纤维细胞中HIF‑1、Oct4和Uhrf1的表达，在蛋白和mRNA水平对其进行分析。