[发明专利]基于CRISPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9体外改造腺病毒载体的方法。本发明还提供了适于改造大质粒载体的分子克隆方法，包括如下：根据出发质粒的待改造位点设计合适的sgRNA，采用Cas9蛋白和sgRNA体外切割所述出发质粒，再基于同源重组的方法将被切割的出发质粒与目的基因相连接，从而完成改造。本发明所提供的方法有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突变、构建结构域缺失的截短体等，本发明有效解决了点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点。

主权项

1.一种构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法，包括如下步骤：(1)采用Cas9蛋白、向导RNA1和向导RNA2切割pAD‑DEST 5型腺病毒载体，回收所述pAD‑DEST 5型腺病毒载体的骨架大片段；所述向导RNA1为序列表中序列7所示的单链RNA；所述向导RNA2为序列表中序列8所示的单链RNA；(2)以35型腺病毒纤毛基因为模板，采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；(3)利用Gibson连接法将步骤(1)获得的所述pAD‑DEST 5型腺病毒载体的骨架大片段和步骤(2)获得的所述PCR产物进行同源重组拼接，所得产物即为Ad5F35嵌合型腺病毒载体。