[发明专利]一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法

摘要

一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，属于免疫分析技术领域。本发明用原核表达的单增李斯特菌P60蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠，经免疫、融合、多重筛选得到15株李斯特菌属特异性单克隆抗体，分别标记辣根过氧化物酶HRP，并以单增李斯特菌CMCC54003为目标物进行两两配对。经筛选不同配对的交叉反应，以2G7为包被抗体、2H8‑HRP为酶标抗体建立夹心ELISA方法对包括单增李斯特菌在内的李斯特菌属均有交叉反应。对测试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌没有交叉反应。本发明制备了李斯特菌属特异性的单克隆抗体并建立了双抗体夹心ELISA法，为食品中李斯特菌属的特异性快速检测提供了技术手段。

主权项

一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，其特征在于酶标板上包被了包被抗体2G7，可特异性捕获李斯特菌属内的李斯特菌，2H8‑HRP为酶标抗体，包被抗体2G7与李斯特菌结合后催化底物在450nm产生吸收值，P/N≥2.1时被判定为阳性，反之，P/N＜2.1则判定为阴性；抗体2G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10875；酶标抗体2H8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10876；步骤为：（1）李斯特菌属单克隆抗体的制备以原核表达的单增李斯特菌P60蛋白为免疫原，免疫8周龄BALB/c小鼠，经常规免疫、融合后用单增李斯特菌CMCC 54003菌体包被检测阳性，得到的阳性孔用ATCC 19111、ATCC 19115、ATCC 19118、CMCC 54002、CMCC 54004、CMCC 54007、冻牛肉分离株以及李斯特菌属的ATCC 19119、ATCC 33090、ATCC 35897、ATCC 25400包被的板检测细胞株的交叉反应，挑选对李斯特菌属均有交叉反应的强阳性孔进行亚克隆；随后3次亚克隆后第7天均采用同样的方案检测阳性孔的交叉反应并选孔进行亚克隆；多重筛选得到15株李斯特菌属特异性单克隆抗体，分别标记辣根过氧化物酶HRP，并以单增李斯特菌CMCC54003为目标物进行两两配对；配对参数如下：包被抗体2G7 4μg/mL；包被液为pH 9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品CMCC 54003浓度5×10^7CFU/mL；标品稀释液含0.1% Tween 20的pH 7.2、0.01M的PBS；酶标抗体2H8‑HRP稀释1000倍使用，在此条件下，实验成功得到了18对P/N>5的配对；（2）李斯特菌属特异性ELISA方法的建立配对后，比较不同配对的检测限和交叉反应；在此基础上，用包被抗体2G7和酶标抗体2H8‑HRP建立了李斯特菌属特异性的夹心ELISA分析方法；具体参数如下：包被抗体2G7包被浓度：4μg/mL，包被液：pH 9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，标品稀释液：含0.1% Tween 20的pH 7.2、0.01M的PBS溶液，酶标抗体2H8‑HRP浓度：2μg/mL，反应时间：包被、封闭：37℃，2h；标准品：37℃，1h；酶标抗体37℃，1h；显色10min；本方法对包括单增李斯特菌在内的李斯特菌属的快速，高灵敏检测；对单增李斯特菌ATCC 19111、ATCC 19115 、ATCC 19118、CMCC 54002、CMCC 54003、CMCC 54004、CMCC 54007、冻牛肉分离株以及李斯特菌属的ATCC 19119、ATCC 33090、ATCC 35897、ATCC 25400的实际检测限P/N≥2.1分别为1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.22×106CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL、4.53×104CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL、1.36×105CFU/mL；同时对P60蛋白的实际检测限达到了0.137 ng/mL，线性范围为0.13‑11.1ng/mL；对测试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌没有交叉反应。