[发明专利]一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法。本发明针对设计的口蹄疫病毒多肽，将采用ELISPOT和构建四聚体两种方法筛选和鉴定口蹄疫病毒多肽，构建荷包猪SLA‑2重链四聚体，并在原核表达系统pET‑21a(+)/BL21进行了表达，包涵体提取；口蹄疫病毒多肽，通过ELISPOT方法筛选具有引起特异性CTL反应的多肽，然后将多肽与SLA‑2重链、已有的轻链β2m进行复性、生物素化以及与FITC标记链霉亲和素反应生成SLA‑2‑BSP/肽四聚体，然后通过流式细胞术检测四聚体的功能。本发明通过ELISPOT方法鉴定得到了猪亚洲I型口蹄疫病毒VP1的一条特异性多肽表位，并成功构建了肽四聚体，检测了其特异性CTL，初步建立了猪四聚体技术平台，为研究猪特异性CTL免疫应答以及T表位筛选奠定基础。

主权项

一种亚洲I型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法，其特征在于，步骤如下：1)、猪口蹄疫病毒SLA I限制性CTL表位设计以NetMHCpan 2.8 Version为模板，将克隆的包括荷包猪SLA‑2在内的SLA I类分子各功能基因提交于在线网站模板，与网站原有的SLA I类分子各功能基因组成猪源病毒CTL表位的预测在线工具，将O型口蹄疫病毒Tibet/CHA/99(HuBHK99)、A型口蹄疫病毒A‑HuBWH(1)2009以及亚洲I型口蹄疫病毒1/Jiangsu/China/2005三种毒株的VP1和3D非结构蛋白序列分别输入预测模板，进行CTL表位的预测，选择具有高亲和力的多肽候选表位：2)、ELISPOT试验：(1)无菌PBS稀释包被IFN‑γ单克隆抗体至10μg/mL，pH7.4；(2)取出ELISPOT专用板，每孔加入50μL 70％的乙醇处理，处理时间最多不要超过1min，达到膜润透即可，弃去乙醇溶液，每孔加入200μL无菌水洗5次，每孔加100μL稀释好的IFN‑γ单抗溶液，4‑8℃过夜孵育；(3)次日，吸去抗体溶液，每孔200μL无菌PBS洗2次；(4)每孔加入20μL封闭液，37℃封闭2h，吸去封闭液，每孔加200μL完全培养基，室温孵育至少30min；(5)吸去培养基，每孔加入100μL预先稀释的多肽和稀释至2.5×10⁵cells/mL的PBMC细胞悬液，每个样品设置3个重复；(6)盖好板盖，37℃、5％CO₂条件下孵育培养18～20h，培养期间，不可扰动细胞；(7)吸去细胞悬液，每孔200μL无菌PBS洗5次，用含0.5％FBS的PBS稀释检测抗体至0.5μg/mL，每孔加入100μL，37℃孵育2h，按照步骤(3)完成清洗；(8)用含0.5％FBS的PBS稀释链酶亲和素，每孔加100μL，37℃孵育1h，按照步骤(3)完成清洗；(9)每孔加100μL显色液避光放置，视斑点形成情况反应5～30min，以去离子水洗涤每孔来终止底物显色反应，室温风干2h或过夜待其完全干燥，于密封塑料袋中长期保存，对ELISPOT斑点计数，完成图像获取，进行分析统计并质控；3)、重链SLA‑2‑BSP与轻链sβ2m四聚体化(1)、菌体培养A：重链SLA‑2‑HB‑BSP和轻链β2m表达检测活化重链重组菌SLA‑2‑HB‑BSP/BL21和轻链重组菌β2m/BL21，分别接种5mL、含有100μg/mL Amp的培养基，37℃培养至OD₆₀₀达到0.4‑0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，取菌体SDS‑PAGE检测蛋白表达情况，重组菌SLA‑2‑HB‑BSP/pET‑21a(+)‑BL21经过诱导，12％SDS‑PAGE检测，其表达正常，轻链β2m/pET‑21a(+)经过诱导和SDS‑PAGE检测，证实该蛋白表达正常，重链SLA‑2‑HB‑BSP和轻链β2m均适合进行下一步的四聚体制备，将SDS‑PAGE检测正确表达的重链SLA‑2‑HB‑BSP/pET‑21a重组菌以及轻链sβ2m/pET‑21a重组菌37℃过夜培养，B：分别以1:100的稀释度稀释过夜培养物到1L LB中，37℃培养到OD₆₀₀＝1，加入IPTG至终浓度到0.5mmol/L，继续培养4小时，收获细菌，重链SLA‑2‑HB‑BSP和轻链β2m各1升；(2)、包涵体制备A：细菌用30mL PBS悬浮，650W超声破菌，5sec on/10sec off，10min，B：包涵体用25mmol/L Tris‑HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl，1％Triton‑X100洗涤液洗2次，C：包涵体用25mmol/L Tris‑HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl洗涤液洗1次，D：包涵体用含有8mol/L尿素的25mmol/L Tris‑HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl溶解，到蛋白质浓度为10mg/mL；(3)、复性在4℃条件下，往500mL的100mmol/L Tris‑HCl，pH8.0，400mmol/L Arginine，5mmol/L reduced Glutathione，0.5mmol/L oxidised Glutathione中加入15mg重链SLA‑2‑HB‑BSP、10mg轻链β2m和5mg As63表位肽，搅拌48小时，得到复性液；(4)、MHC单体的生物素化500mL的复性液，浓缩到5mL，用PD10柱进行缓冲液交换，新缓冲液为10mmol/L Tris pH8.0，将试剂盒中成分加入到上述蛋白质溶液中，室温处理16小时；(5)、生物素化单体的分离将上述过夜的蛋白质溶液进行AKTA FPLC分离：分离柱Hiload 26/600Supdex 75pg，分离缓冲液为20mmol/L Tris‑HCl pH8，100mmol/L NaCl；流速1mL/min，收集洗脱体积为163ml的蛋白峰，浓缩到1mg/mL；(6)、单体的鉴定A：SDS‑PAGE，将上述FPLC分离的单体，点样8μg，如果看到重链SLA‑2‑HB‑BSP以及轻链β2m两条带，表明复性后单体已经形成，B：ELISA检测，4℃过夜包被FPLC分离的单体，每孔2μg，两孔，同时加入未生物素化的单体作为对照，用HRP标记的strepavidin进行检测单体的生物素化情况，按照每1mg生物素化单体加0.312mg extravidine‑PE的量混合，形成PE标记好的SLA‑2‑HB‑BSP/As63四聚体；4)、SLA‑2/HB/As63Tetramer流式检测(1)分离1/Jiangsu/China/2005毒株攻毒组猪的外周血单核细胞，1500rmp室温离心3min，弃上清，以pH 7.2的PBS洗涤细胞一次，并再次离心，(2)将细胞沉淀重悬于FACS洗涤液，(3)在细胞悬液中加入5μL PE标记的SLA‑2‑HB‑BSP/As63四聚体，室温避光反应20min，(4)加入2mLFACS洗涤液重悬细胞，500×g室温离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬于100μLFACS洗涤液，(5)加入5μL、2.5μg FITC标记的Anti‑pig CD8a抗体，在室温继续避光反应20min，(6)加入FACS洗涤液洗涤细胞一次，1500rmp室温离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬于300～400μL的FACS洗涤液中，其中的FACS洗涤液含0.1％NaN₃和0.1％BSA的1×PBS(7)细胞悬液样品经流式细胞术分析并分选，针对于As63多肽表位的特性型的CTL，约占总细胞的8.21％，与对照组0.1％形成极显著的差异P<0.01，证明SLA‑2‑HB‑As63‑sβ2m四聚体制备成功，同时证明As63为口蹄疫病毒特异性的CTL表位。