[发明专利]一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法

摘要

本发明公开一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体方法包括制备荧光磁性微球；制备荧光检测抗体；制备荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度，本发明将流式细胞术与荧光免疫磁性微球相结合检测蛋白质浓度，采用该方法进行特异性蛋白质分子浓度检测，反应体系小，测量更精准，检测下限为pg/ml级，具有较高的特异性和敏感性，操作更方便快捷，操作步骤简化，直接孵育无需分步孵育洗涤，缩短反应时间，检测结果时间更短，定量更精确。

主权项

1.一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，其特征在于：联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，选取罗丹明123标记磁性微球，PE‑cy7标记检测抗，具体包括以下步骤：步骤1：将荧光染料修饰在磁性微球上制备荧光磁性微球；具体的制备方法如下：(1)称取3mg罗丹明123染料，溶解于10mL去离子水中制得1mmol/L的染料母液；在10mL去离子水中加入300mg密胺及750mg乌洛托品之粉末，搅拌令其充分分散，并置于65℃水浴条件下加热搅拌反应2小时；滤纸后加入10μL 1mM的罗丹明123母液，充分混合，并将其室温静置1小时再置于4℃保存；(2)称取20mg磁性微球，分散于10mL稀硝酸，其pH为3.5，并加入2mL上述(1)制备的荧光聚合物溶液中；超声处理使反应物充分分散均匀混合后，置于95℃油浴加热体系中反应30分钟，再加入20mL冰水混合物终止反应；离心分离所得的荧光磁性微球，反复3次离心分离并用水重分散以洗涤产物，真空干燥；(3)称取10mg上述(2)制备的荧光磁性微球，分散于2mL水与8mL乙醇之混合溶剂中，超声处理使微球充分分散得到微球悬浮液；向此微球悬浮液中加入0.1mL氨水以及30μL四乙基硅烷，搅拌条件下反应24小时；反应结束后反复3次离心分离并用水重分散以洗涤产物，真空干燥；步骤2：将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备荧光检测抗体；(1)称取10mg步骤1制备的荧光磁性微球，分散于10mL pH为3.5的稀硝酸与40mL乙醇的混合溶剂中，充分分散后加入0.05mL氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌条件下反应24小时；反应结束后反复3次离心分离并用水重分散以洗涤产物，真空干燥；(2)称取10mg上述(1)中干燥后的磁性微球，分散于5mL四氢呋喃中，充分分散后加入5mg丁二酸酐，搅拌条件下反应6小时；再将活化的荧光磁性微球分散于5mL交联缓冲溶液中，加入BSA单克隆抗体，混匀后室温避光孵育2小时；交联结束后，加入1mg甘氨酸终止反应，离心，弃上清，将表面交联有抗体的微球重悬于保存液中，4℃保存；其中，交联缓冲溶液为吗啉乙磺酸溶液，pH为6.0；(3)用上述(2)的交联方法在不同表位的BSA单克隆抗体上交联荧光染料PE‑cy7，4℃保存；(4)将已交联荧光染料PE‑cy7的BSA单克隆抗体按照一定比例交联在活化荧光磁性微球的表面，4℃保存用于流式细胞仪FSC、SSC参数以及PE‑cy7的荧光调节；步骤3：将步骤1获得的荧光磁性微球表面进行氨基化和酰胺‑羧基化修饰，再分别将该蛋白质不同荧光检测抗体对应表位的特异性单克隆抗体和特定荧光标记量的荧光检测抗体交联在活化的荧光磁性微球表面，制成荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；步骤4：制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度；所述步骤4中制作标准品工作曲线的制作方法为使用步骤3获得的校准磁性微球、荧光免疫磁性微球和步骤2获得的荧光检测抗体联合流式细胞仪检测蛋白质不同浓度标准品对应的平均荧光强度，制作标准品工作曲线。